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1、,2.3 DNA的复制DNAReplication and Synthesis,第二章 染色体与DNA,Transmission electron micrograph of human a HeLa cell, illustrating the replication bubble that characterizes DNA replication within a single replicon.,A Picture Paints a Thousand Words. or more?,Because a figure is as informative as 1000 words.,DN
2、A Replication Mode,1. Three Possible Modes of DNA Replication,（1）Conservative replication（全保留复制）,（2）Dispersive replication（分散复制）,2.3.1 DNA的半保留复制 核酸复制规律的一般猜想,在DNA复制时，DNA并不需要解链，只是在复制位点解开几个碱基，亲代分子保持完整。在这个模型中，亲代分子并不需要解链,。,亲代DNA分子先打成片段然后再互为模板，这样的话，亲代DNA片段分散在子代DNA分子中,（3）Semiconservative replication（半保留复制）
3、,unwound,rewound,Base match,Generalized model of semiconservative replication of DNA,Matthew Messelson Franklin Stahl,中国科学院上海生化与细胞所2019年招收硕士研究生分子遗传学入学考试： 请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的（8分）。,MeselsonStahl实验：1958年， Meselson和Stahl首先将大肠杆菌在含重同位素15N的培养基中培养约十五代，使所有细菌都被15N标记。然后移至只含有轻同位素14N的培养基中同步培养一代，二代，三代。分别提取D
4、NA，作CsCl密度梯度离心，观察DNA的位置。,15N标记的DNA密度大于正常14N的DNA密度，在离心管较低的部位形成一条区带；正常的DNA应该在它的上面。这种重标记的DNA在14N培养液中复制一代，重密度带消失了，而在比正常DNA稍低的地方形成一个带，即中间密度带（如果是半保留复制，在第一代中，DNA是密度杂交分子，两条链中一条链是亲代15N标记的重链，另一条是正常含14N的轻链，这样两条链形成密度上杂交的DNA分子）。在14N培养液中再复制一代，就会出现两条带，一条在中间密度区域，一条在轻密度区域。随着在14N培养液中培养的代数的增加，中间密度区的区带量逐渐减少，低密度区带的量逐渐增加
5、，但并不出现新的区带。这个实验证明了DNA的复制是半保留复制。,The Meselson-Stahl experiment.,the most beautiful experiment in biology,15N标记氮源,14N标记,细胞在14N中复制一次,细胞在14N中再复制一次,细胞在14N中再复制一次,The expected results of two generations of semiconservative replication in the Meselson-Stahl experiment.,MeselsonStahl实验的改进之一,对15N-DNA、14N-DNA杂
6、交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。结果变性前的杂交分子为一条中间密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带（15N-DNA）和低密度带（14N-DNA）。,第0代 只有15N，第一代出现杂合分子，两代后出现等量的14N和14N-15N杂合分子。纯粹15N的分子没有的了，说明老链保留到了新链中了。,3. Semiconservative Replication in Eukaryotes,Taylor-Woods-Hughes experiments：,1957, root tips of Vicia faba（蚕豆）,Radioisotope 3H labele
7、d thymidine,Autoradiography（放射自显影）,蚕豆病是葡糖六磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏者进食蚕豆后发生的急性溶血性贫血。蚕豆(viciafaba)又名胡豆黄,Telophase,Results,Semi-conservative replication of chromosomes can also be visualized through an examination of chromosomes that are allowed two rounds of replication in a medium containing bromodeoxy-uridine.
8、 These replicated chromosomes are then stained with a fluorescent dye and Giemsa stain to produce what are described as harlequin chromosomes,DNA半保留复制的生物学意义,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。,为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之前，遗传信息载体必须精确地复制自己。过去的概念认为遗传信息的载体就是DNA，现在发现许多病毒的遗传信息载体是RNA而不是DNA。因此，我们除了对DNA的复制作详细的
9、论述外，对RNA的复制也加以阐述，以期对遗传信息的复制有个全面的了解。1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋模型时就指出，由于互补碱基的配对原则，在DNA复制时，只要双链DNA解开，以每一条链为模板以合成其互补链，即可形成两个与亲代完全一样的DNA分子。DNA复制的基本过程正如Watson和Crick所预测的那样，但是在DNA复制中涉及了许多细胞成分。DNA的复制过程大体上可以分为复制的启动，复制的延伸，和复制的终止三个阶段。,DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Origin of replication)，用ori表示,2.3.2
10、 复制的起点方向和速度,一个复制子：replicon,一个复制子：replicon,大肠杆菌Single origin,Bidirectional Replication,oriC,ter,复制叉,复制叉,复制速度E.coli 37 0.5 h 105 bp/min,Multiple Origins in Eukaryotes,复制速度mammalian cell 500-5000 bp/min,复制的多模式,单起点、单方向（原核）,多起点、单方向（真核）,多起点、双方向（真核）,腺病毒、29噬菌体、线粒体等,2.3.3复制的几种主要方式page40,“复制方式”不同于“复制机制”线性DNA的
11、复制： 典型的复制叉式的复制环状DNA的复制： 复制 滚环复制 D环复制,2.3.3 DNA复制的几种主要方式,1. 线性DNA双链的复制,特点在于：1、多个起点，起点都不在线性DNA的端点（末端），而是在内部2、采用复制叉式的双向复制，两个复制叉，两个方向，有先导链和后随链之分3、末端的复制采用特殊的3种方式（后面讲）4、真核生物采用的复制方式：,2. 环状DNA双链的复制,复制:首先由J.Carins 从大肠杆菌中观察到,又称为 Carins复制。（双向复制） 滚环复制（rolling circle replication)（单向复制） D环复制（D loop replication)：线
12、粒体DNA复制（单向复制）,John Cairns experiment,In 1963, John Cairns:Grew E. coli in 3H thymidineWaited till cells were in the middle of replicationLysed the cells very very gentlySpread the lysate on an EM gridExposed the grid to X-ray film for TWO monthsReplication of the E. coli chromosome,经典实验分析 Origin of
13、Replication,复制,约翰凯恩斯,The replication eye becomes larger as the replication forks proceed along the replicon. Note that the eye becomes larger than the nonreplicated segment. The two sides of the eye can be defined because they are both the same length. Photograph kindly provided by Bernard Hirt.,Ori
14、gins can be mapped by autoradiography and electrophoresis,what Cairns experiment showed:E. coli has a circular chromosomeE. coli has a single origin of replicationIn E. coli, replication and unwinding aresimultaneous,John Cairns provided a well-designed demonstration of E. coli chromosomal replicati
15、on in 1963. In his experiment, he radioactively labeled the chromosome by growing his cultures in a medium containing 3H-thymidine. The nucleoside base was incorporated uniformly into the bacterial chromosome. He then isolated the chromosomes by lysing the cells gently and placed them on an electron
16、 micrograph (EM) grid which he exposed to X-ray film for two months. This Experiment clearly demonstrates the theta replication model of circular bacterial chromosomes,What Cairns did not show:, Is replication unidirectional or bidirectional? Is the origin of replication unique? Where is the origin
17、of replication located?, Cycle chromosome, Semicoservative replication, Directly measure the chromosomal length of E.coli,Conclusions:, Unwound-replicate-rewound, Only one origin（oriC）,Two cycles linked as a pattern.,1100m,11000003.4=3.2106 bp,复制的特点,多数环状DNA采用的复制方式复制叉式复制，两个复制叉，双向等速或者不等速复制有先导链和后随链之分,滚
18、环复制,环状亲本DNA，双链,ori,限制性内切酶在复制起点识别特异序列，切开一条单链,3-OH,5-p,5末端常常与特殊的蛋白质结合，受到保护，而在3末端不断地由DNA聚合酶催化，以没有切断的那条环形链为模板，合成新的互补链,3-OH,5-p,3-OH,这里的新生链是共价结合在模板链的互补链上的,3端不断的滚动，而5端则不断地被甩出去,？,以单链为模板，通过不连续复制（冈崎片段），复制出另外一条链，最后通过切割和连接重新环化。,X174,滚环型复制：,单向复制的特殊方式 T. Brown et al., 如：174的双链环状DNA复制型（RF）（1）模板链和新合成的链分开;（2）不需RNA引
19、物，新生链在正链3OH上共价延伸延伸（3）只有一个复制叉;复制是单向的,(4)滚环复制也有先导链和后随链之分,ROLLING-CIRCLE MODEL OF BACTERIOPHAGE l DNA REPLICATIONTHIS SCHEME RELATES TO THE SYNTHESIS OF DOUBLE-STRANDED DNA,D环复制,单向复制的特殊方式线粒体DNA、叶绿体DNA两条链的复制高度不对称一个或者多个起点没有先导链和后随链之分,特殊的DNA复制方式,用蛋白质做引物的复制腺病毒腺病毒DNA的复制是以前末端蛋白（pTP）为引物进行的单向复制。 腺病毒的DNA复制首先是以5端
20、结合有pTP的dCMP作为引物，以3端的末端反向重复序列（ITR）为模板，进行链置换（strand displacement）合成，置换出的单链分子可以自我退火环化，形成锅柄样环形分子，然后这种环形分子再以相同的机制合成出子代双链DNA分子。,DNA聚合酶（polymerace, Pol）与pTP共同作用于末端复制原点，形成起始前复合物（preinitiation complex）。pTP和Pol均是病毒早期基因表达蛋白，由E2转录单位编码。在病毒DNA多聚酶的作用下，沿5到3方向连续地合成病毒DNA。这一过程还需E2编码的单链DNA结合蛋白（DNA binding protein, DBP）
21、及细胞拓扑异构酶参与。其中DBP结合于被置换下来的另一条亲本链上，而拓扑异构酶可辅助复制叉的延伸。由于线形的腺病毒基因组末端反向重复序列的末端均有一个复制原点，因此两条亲本链可通过这种置换机制进行复制。腺病毒DNA复制时仅以一条亲本链为模板，复制完成后产生一条dsDNA子代链及一条被置换出的亲本单链。亲本单链通过末端重复序列互补产生柄环样复制中间体，以双链柄端为模板合成另一条子代DNA分子。,腺病毒DNA的复制起始，不需RNA引物,避免了5-end shortent,另外一种复制的表述方式,根据DNA合成的起始方式，复制可以分为两种类型，一类是从新起始，即先导链是从新开始的，这种类型主要是复制
22、叉式复制，占大多数另一类是共价延伸，即先导链是共价结合在一条亲本链上，这种类型主要是滚环式复制。,区别于教材,2.4 与DNA复制有关的物质9类,1、底物：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA,DNA复制实际上就是DNA指导的DNA合成代谢。因此，必须有DNA作为复制的模板。体外复制实验证明，新合成DNA的特异性完全取决于事先加入的模板DNA，三磷酸核苷酸(dATP,dGTP，dCTP，dTTP)是合成原料。有模板和合成原料后，细胞内还有许多酶和蛋白质参与DNA的复制。,与DNA复制有关的物质9类,3、引物：DNA的合成
23、需要一段RNA链作为引物4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。,与DNA复制有关的物质9类,1、底物：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。,5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物反应需要有模板
24、的指导反应需要有3-OH存在DNA链的合成方向为5 3 ,原核生DNA聚合酶的性质,真核生DNA聚合酶的性质 p49,与教材有一定的区别,DNA聚合酶详解(补充兼复习),5,5,3,3,Klenow片段,RNA引物,3模板链,大肠杆菌DNA聚合酶I(DNApolymerase，DNApol),大肠杆菌DNA聚合酶1的理化性质,纯化的DNApol由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个-SH基。通过二个酶分子上的-SH基与Hg2+结合产生二聚体，仍有活性。每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个大肠杆菌细胞中含有约400个
25、分子，每个分子每分钟在37下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。,Klenow片段,经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow片段，小片段的分子量为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。,DNAPol I活性中心,在空间结构上近似球体，直径约650nm。在酶的纵轴上有一个约200nm的深沟(cleft)，带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点:1模板DNA结合位点;2DNA生长链或引物结合位点;3引物末
26、端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3-OH;4脱氧核苷三磷酸结合位点;553外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5-端脱氧核苷酸并切除之;635外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3-端核苷酸。,大肠杆菌DNA聚合酶I的功能,1 聚合作用：在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol I逐个将核苷酸加上去，就是DNApol I的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对
27、，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。,2 35外切酶活性校对作用:,这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被35外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，35外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被35外切酶切除，以
28、便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。,3 53外切酶活性,切除修复作用:53外切酶活性就是从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端DNA引物的去除也依赖此种外切酶活性。,53外切酶活性可以导致三种反应,4焦磷酸解作用:,DNApol的这种活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，
29、而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。 (dNMP)n+XPPi(dNMP)n-x+X(dNTP)DNA,5 焦磷酸交换作用,催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA,DNA polymerase III,6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用,7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)：
30、 拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶,上海生化所2019年分子遗传学试题：拓扑异构酶,8、DNA 解螺旋酶 /解链酶（DNA helicase) 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。,rep蛋白沿3 5移动，而解螺旋酶I、II、III沿5 3移动。,9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,Activities at the Replication Fork,DNAP I and DNAP III, helicase (DnaBC, Rep), DNA gyrase, SsB, primase, DNA ligase,谢谢！,
