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1、2022人羊水干细胞研究进展(全文)干细胞一直是生物学界和医学界的研究热点。根据来源不同，干细胞分为胚胎干细胞(embryonicstemcellrESC)和成体干细胞，这2种细胞各有优势与局限性。近年来发现的介于两者之间的羊水干细胞(amnioticfluid-derivedstemcell,AFSC),以其特有的优势成为一种新的干细胞来源。AFSC从产前诊断时羊膜腔穿刺所得标本中获得，取材方便，避免了伦理的限制，且无致瘤性。AFSC具有向外、中、内胚层细胞分化的潜能，可诱导分化为神经、肌肉、心血管、皮肤等组织，为疾病治疗和基因治疗的研究提供新的干细胞来源。本文将简要介绍ESC和成体干细胞的
2、特点以及AFSC的发展历程,讨论AFSC的生物学特性，并阐述其在疾病治疗方面的进展。一、ESC和成体干细胞的优势与局限性干细胞是一类能够自我复制、具有多向分化潜能的细胞。干细胞可从多种组织中获取，比如骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、胚胎肝脏等。根据来源不同，干细胞可分为ESC和成体干细胞。ESC是从囊胚的内细胞团分离得到的，可分化为3个胚层的细胞，但因具有异体免疫排斥、移植后畸胎瘤形成以及伦理等问题限制了其应用。诱导多能干细胞(inducedpluripotentialcellliPSC)是一种ESC样的多能干细胞,于2006年首次报道1。该研究通过转导4种转录因子(Oct34.So2xc-Myc
3、xKlf4)成功将鼠成纤维细胞诱导为多能干细胞且证实iPSC的生物学特性与ESC类似。2007年，这一研究团队在体外又成功诱导出人iPSC2其后，又有多个研究应用逆转录病毒、慢病毒载体、多顺反子载体转导4种转录因子或用不含病毒载体成功诱导出iPSCiPSC解决了免疫排斥与伦理的问题，但由于其技术要求高、效率低，同时用病毒作为载体，其应用的安全性不明确。尽管非病毒载体已成功应用于成人体细胞的诱导，但是产生iPSC的效率并不高。成体干细胞主要有间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、肠干细胞等，具有多潜能性，易于从组织中获取，但是从多种组织中
4、分离及体外扩增较困难，且只能分化为特定的组织，使得其应用受到限制。因此，干细胞研究需要寻找一种不受以上限制的新型干细胞来源。AFSC作为一种新型干细胞来源，不仅解决了ESC异体免疫排斥、移植后畸胎瘤形成以及伦理等问题，而且取材方便，易于分离，具有分化为内、中、外3个胚层的潜能，是介于成体干细胞和ESC之间的良好种子细胞。二、AFSC的发展1993年Jorricelli等3在妊娠12周孕妇羊水中发现一种细胞,呈圆形、核小，类似于造血祖细胞。随后的研究于2002年在妊娠14周孕妇羊水中分离出能表达Oct4、波形蛋白和碱性磷酸酶的多能细胞群，首次证实了羊水中存在多能干细胞4。Oct4是转录因子POU
5、(Pit-Oct-Unc)家族的一员，在维持干细胞多能性中发挥重要调控作用。2003年，有研究从羊水中分离到具有多谱系分化潜能的MSC1这些细胞有较强的增殖能力,能够分化为脂肪细胞、骨细胞和神经元，可阳性表达MSC表面标记物如CD90、CDIo5、CD73和CD166,但不表达造血干细胞表面标记物如CD45、CD34和CD145o2007年有研究利用免疫磁珠技术分选出c-kit(CD117)阳性的AFSC1发现培养这些细胞不需要饲养细胞，长期培养没有畸胎瘤形成，即使倍增250代仍保持正常核型和端粒酶活性，并检测到这些细胞表面能表达ESC和成体干细胞表面标记物6。随后大量研究证明了AFSC的多向
6、分化潜能，在体外不同培养环境下可被诱导分化为内、中、外3个胚层的细胞类型，而且分化后的细胞保持稳定的生物学特性，且具有相应类型细胞的特异性功能。羊水中主要有3种干细胞:羊膜上皮干细胞、羊膜间充质干细胞和AFSC,其中羊膜上皮干细胞来源于羊膜上皮层，羊膜间充质干细胞来源于羊膜成纤维细胞层，而AFSC可能来源于胎儿的皮肤、消化道、呼吸道和泌尿道等组织和羊膜刀。这些细胞可通过不同的选择性分离方法，细胞的形态和生长特点以及细胞标记物加以区分8。三、AFSC的分离与培养原代羊水细胞包括2种细胞群:贴壁细胞和非贴壁细胞，通过贴壁细胞对培养基的黏附作用可对羊水细胞进行分离培养。妊娠中期行产前诊断的孕妇，通过
7、超声引导下羊膜腔穿刺获取少量羊水，室温离心，制成细胞悬液接种于培养基后，在37.5%C02的培养条件下进行培养，细胞达70%80%融合时进行传代培养。常用的培养基为含有胎牛血清、ChangB、ChangC,谷氨酰胺及抗生素等的-MEM培养基。也可采用CD117免疫磁珠或流式细胞仪分离出CDll7+-AFSC6,分离出的AFSC可以在无饲养层细胞的培养基中良好生长。四、AFSC的生物学特性1.形态学：不同培养时间AFSC的形态与生长状态不同。原代培养7d细胞贴壁形成细胞克隆，这些细胞克隆根据形态可分为上皮样细胞和成纤维样细胞。上皮样细胞较大，呈多角形，细胞间紧密连接，而成纤维样细胞呈梭形，随着培
8、养时间的延长，成纤维样细胞成为主要的细胞克隆9。也有研究发现,分离的AFSC在培养初期，细胞贴壁生长，形态可呈上皮样、成纤维样、圆形等，随着培养时间的延长，逐渐形成梭形细胞为主的细胞克隆，存在少数类似成纤维细胞的集落和多角形铺路石样上皮细胞样集落,连续进行多次传代后，可以发现上皮样细胞明显减少，最后基本消失，形成形态均一的梭形细胞10。2 .干性：AFSC可表达MSC及ESC的部分表面标记物及基因产物，是处于MSC和ESC中间阶段的干细胞。AFSC可表达多潜能性标记物如OCt4、SSEA3sSSEA4、NANOGxKLF4、MYCxTRAl-60和TRAl-8111-12.早在2002年就有研
9、究发现AFSC可表达ESC特异性基因产物Oct44,随后被大量研究证实。0ct4在干性调节中起关键作用，当细胞分化时其水平下调。但是关于Oct4是否在调控干细胞增殖与分化中起关键作用一直备受争议13。AFSC还可表达MSC的表面标记物CD90、CDIo5、CD73、CD44和CD29,而不表达造血干细胞标记物如CD45、CD34、CD133,也不表达组织相容性复合体H、CD40、CD80、CD8614o最近一项研究显示，随着培养代数的增加，CD105的表达增多9。由于CD105是一种MSC表面标记物，长期的培养可能更有利于细胞向MSC方向分化。尽管已有大量研究证实了这些标记物在AFSC的表达，
10、但是不同文献所报道的标记物和其阳性表达率不尽相同，这可能是由于分离方法和培养条件不同，或者是取自不同胎龄和不同个体的标本中AFSC本身的异质性所致。探寻特异性的标记物，建立统一的分离纯化标准将有助于AFSC的鉴定。3 .可诱导性：羊水细胞可像成人体细胞一样诱导为iPSC,且其诱导出的细胞在形态学和标记物表达上具有与ESC及成人体细胞诱导的iPSC相似的特点，且其诱导更为高效15。然而，此研究只对羊水中终未分化细胞进行诱导。直到2012年,Moschidou等11首次应用丙戊酸实现对AFSC的重编程,该研究将c-kit+-AFSC与含有丙戊酸的ESC混合培养从而获得重编程的AFSC,这些细胞可在
11、体内或体外形成胚体，即使长期培养，仍具有良好的遗传稳定性和生长动力学,并可向内、外、中3个胚层分化。但是对于AFSC的诱导机制仍不清楚。4 .端粒酶活性：端粒酶是一种能保持染色体末端端粒长度的酶，可以使染色体末端免受破坏或与邻近染色体融合。因人类体细胞缺乏端粒酶活性，染色体端粒长度随细胞分裂次数增加而逐渐缩短。端粒酶活性是人类多能干细胞和ESC的标志。AFSC具有端粒酶活性最早在1999年被检测到，且发现AFSC的端粒酶活性可随着培养时间的延长而逐渐降低16。而2007年一项研究分离出的CD117+-AFSC在体外培养250代以上仍保持端粒长度和端粒酶活性6。这一矛盾的结果，提示AFSC在培养
12、过程中是否能保持其端粒酶活性仍有待进一步研究。5 .免疫性：AFSC移植至体内是否会引起宿主的免疫排斥是影响细胞移植后效果的一个重要因素。2011年一项研究发现,与MSC类似，AFSC也可直接抑制淋巴细胞激活，并能分泌一些免疫调节因子，如GRO(growth-relatedoncogene单核细胞趋化蛋白家族、白细胞介素-6等,从而抑制免疫反应；除此之外，AFSC可分泌巨噬细胞炎性蛋白3a、巨噬细胞炎性蛋白18激活素和单核细胞趋化蛋白1,而低水平表达单核细胞趋化蛋白214o由此推断,AFSC在体外可抑制免疫反应。一些细胞因子在AFSC与淋巴细胞的相互作用中起到关键作用，且可能存在特异性免疫抑制
13、机制。最近一项研究显示,CD117+-AFSC的免疫调节作用随胎龄不同而改变妊娠早期AFSC可明显抑制T细胞和自然杀伤细胞的增殖,而妊娠中晚期AFSC的抑制作用较弱，且妊娠中期的AFSC具有抑制B细胞增殖的作用17。从而认为妊娠早期AFSC具有和胚胎早期相关的免疫调节机制，而妊娠中晚期AFSC的免疫调节作用更类似于成人MSc,具体的调节机制仍需要继续探讨。6 .致瘤性：干细胞在体内无限增殖形成肿瘤一直困扰着干细胞研究者，而AFSC在体内并不会自发形成畸胎瘤。一项动物研究将培养的AFSC注入4周龄裸鼠后腿肌肉处，3个月后注射处肌肉的组织学检查未显示肿瘤形成6o另一项研究将不做任何处理的AFSC注
14、入裸鼠背侧，12周以后检测无畸胎瘤形成，而用丙戊酸预处理过的AFSC注射入小鼠体内则检测到畸胎瘤的形成11。表明AFSC注射至体内并不自发形成畸胎瘤，但是重编程后的AFSC具有致瘤性,具体机制仍需进一步研究。通过不同传送细胞的方式移植AFSC是否引起畸胎瘤的形成也需要深入探讨。五、AFSC在疾病治疗研究中的应用尽管对于AFSC的分离鉴定仍存在许多问题，但已有大量体外实验或动物模型研究构建出AFSC细胞系,并研究其分化能力和治疗作用。1. AFSC在脑卒中和神经系统分化中的作用：Tajiri等18通过向缺血性卒中小鼠模型脑室内注射AFSC,发现小鼠的运动功能和认知功能明显恢复,组织学显示梗死面积
15、缩小，海马齿状回和侧脑室室管膜下区细胞增殖标记物Ki67、神经元标记物微管相关蛋白2水平明显升高，提示AFSC可通过增强内源性损伤修复机制在卒中的治疗中发挥作用。在神经系统分化调节的研究方面，有研究通过对一些标记物进行筛选和验证，证明S0X9与AFSC的神经发育潜能有关，S0X9基因敲除可抑制AFSC向神经系统细胞分化19。2. AFSC在心肌梗死及血管再生中的作用：BOIIini等20在急性心肌梗死小鼠模型中注入人AFSC,发现这些细胞可以分泌心脏保护因子和促血管生成因子,推测AFSC可能通过旁分泌胸腺肽4机制对心肌梗死有一定的治疗作用。2012年，有研究发现AFSC在血管内皮生长因子的诱导
16、下可形成血管内皮样细胞21。将纤维蛋白/聚乙二醇凝胶作为支撑新生血管的生物支架的研究验证了AFSC和羊水干细胞来源的上皮细胞(AFSC-derivedendothelialcellAFSC-EC海外血管形成的潜能22。在此基础上,该研究团队将载有AFSC的纤维蛋白/聚乙二醇凝胶注射至裸鼠皮下，证实AFSC可在体内原位形成血管内皮细胞和红细胞23,纤维蛋白/聚乙二醇凝胶载体的应用也为细胞移植生物支架的开发提供了一种新的选择。3. AFSC在肺上皮的重建和肺疾病治疗中的作用：AFSC也可用于研究肺上皮的重建和肺疾病的细胞治疗。高氧损伤肺组织中的2型肺泡上皮细胞可分泌一些肺泡上皮标记物，使AFSC迁
17、移至损伤区，促进损伤愈合并诱导其分化为肺上皮细胞在AFSC和2型肺泡上皮细胞混合培养的过程中，能够检测到AFSC分泌的生长调节蛋白-a、白细胞介素-6、白细胞介素-8、巨噬细胞移动抑制因子、纤溶酶原激活物抑制剂1,这些细胞因子在抗炎和促进损伤愈合方面发挥重要作用24。GriSafi等25在高氧损伤所致的支气管肺发育异常小鼠模型中，用AFSC作为这种多因素肺疾病的治疗工具，发现肺组织结构得到恢复，可能是通过AFSC的旁分泌机制及免疫调节作用实现的。4. AFSC在肾损伤恢复中的作用：AFSC也可作为治疗肾脏疾病的细胞来源。2010年，一项研究将AFSC直接注入急性肾小管坏死小鼠模型的肾坏死区，注
18、入的细胞可分化为能表达肾近端和远端小管标记物的细胞，并通过分泌一些细胞因子调节免疫反应，促进肾功能的恢复26。Hauser等27通过静脉内注射AFSC的方式研究其对急性肾损伤肾功能恢复的影响,通过定位发现AFSC聚集于肾小管周围毛细血管和间质中，这些细胞可促进肾小管细胞的增生和减少细胞凋亡，从而改善肾功能。进一步体外实验显示，这种作用是通过分泌一些生长因子和细胞因子而实现的，而并非通过移植细胞与损伤组织的结合发挥作用。上述研究与Perin等26研究结论不吻合的原因可能是细胞注射的部位和量不同。另一项研究进一步验证了AFSC并非通过分化为肾脏细胞修复损伤肾的功能，而是通过激活Akt通路,分泌一些
19、细胞因子（如白细胞介素-6、血管内皮生长因子、SCF-I等）刺激肾小管细胞增生等途径促进肾功能恢复，神经胶质细胞营养因子可增强AFSC的上述作用28。六、AFSC在基因治疗领域的应用理论上讲，基因治疗可以从根本上治疗一些遗传病，干细胞可作为基因治疗的良好素材，但是由于技术上和伦理上的限制尚未应用于临床实践。AFSC作为一种新型的多能干细胞,可用于遗传病基因治疗的研究。但是，想要应用AFSC作为致病基因修复和自体细胞移植的细胞来源，必须要有良好的基因转导体系确保AFSC高效表达相关基因产物。近来，有研究应用载有人类免疫缺陷病毒1型、脾病灶形成病毒的长末端重复序列启动子以及标记基因增强型绿色荧光蛋
20、白的慢病毒载体系统转染细胞，这些细胞可表达MSC表面标记物，而不表达造血干细胞和内皮细胞表面标记物，并具有分化为脂肪细胞和骨细胞的潜能29。国内的体外研究将含有目的基因FIX-CDNA和报告基因绿色荧光蛋白的慢病毒载体转入人羊水祖细胞中，发现羊水祖细胞不仅能合成人凝血因子IX,而且能正确剪切及修饰该蛋白，使其具有正常的凝血功能，为血友病的宫内基因治疗提供了新的线索30。然而，该研究未说明所用羊水标本是来自正常家系还是血友病家系（是否有IX因子缺乏而且慢病毒载体的安全性、转染后的人凝血因子IX能否在人体内表达并长期保持活性仍是未知数。AFSC的基因修饰为适合基因治疗的遗传病开辟了新的途径，构建疾
21、病来源的AFSC细胞系,并应用基因组编辑技术敲除致病基因可能是遗传病基因治疗的一个新方向。七、展望AFSC可从产前诊断羊膜腔穿刺所得标本中获取，对母体和胎儿影响较小,可在体外诱导为多种组织细胞用于细胞移植和疾病治疗，且生物学特性稳定，体外实验未发现畸胎瘤形成。因而有望作为一种新型干细胞来源而广泛应用于再生医学和疾病治疗领域。尽管自发现AFSC以来已涌现出大量的研究，但是目前AFSC的研究仍处于初级阶段，尚有许多问题需要攻克，如AFSC的来源以及在体内的生理功能如何；是否有更特异的细胞表面标记物用于AFSC的分离和纯化；AFSC干性的调控机制和诱导分化的调节机制如何；怎样才能构建一个理想的装载AFSC的支架材料；AFSC移植至体内的安全性如何；体内生化环境是否会对AFSC的诱导有干扰；AFSC的宫内移植会对母胎产生怎样的影响；应用AFSC基因治疗有效性如何等等，这些问题都需要进一步探索。
