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1、,RNA的提取原理及提取技术,RNA的分类: rRNA 核糖体核糖核酸 tRNA 转移核糖核酸 mRNA 信使核糖核酸 一个典型哺乳动物细胞含10-5ugRNA，其中 rRNA占80%-85%（28S、18S和5S） tRNA 占15%-20% mRNA占1%-5%,mRNA是单链的，易受到核酸酶的攻击，而RNA核酸酶存在十分广泛且稳定，耐热，能适应较宽的PH范围。,提取RNA 过程中防止RNA酶污染所采取的措施：,1 所有的玻璃器皿在烘箱（186 ）中烘烤4-6h，不能高温灭菌的，用0.1%DEPC水溶液处理，再用洁净的蒸馏水冲洗；2 所用的水先用0.1%DEPC37处理12h以上，再经过高
2、压灭菌；3 全部试验过程中戴手套、口罩操作，并经常更换；,4 RNA电泳槽用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥后，室温下用3%H2O2溶液浸泡10min，最后用0.1%DEPC处理过的水彻底冲洗； 5 工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离，最好是单独的操作空间。,影响RNA提取的因素,材料：切忌使用反复冻融的材料；如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在样品贮存液中，于70或20保存；如要多次提取，请分成多份保存；液氮长期保存，70短期保存。,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解;酵母和细菌：一般TRIz
3、ol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁;动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻。 注意：样品量适当，保证充分裂解。,TRIzol： 主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。,影响RNA提取的因素,纯化： 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解； 亲和层析法纯化。,R
4、NA提取方法,异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中，采用酸性酚/氯仿混合液抽提，低pH值的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA仍留在有机相，从而可以完成RNA的提取工作。,操作步骤：,1 液氮研磨组织或细胞；2 加入trizol试剂，进一步在保证RNA完整的情况下破碎细胞并溶解细胞成分；3 加入氯仿抽提，离心分离水相和有机相，收集含有RNA的水相；4 通过异丙醇沉淀，获得RNA 样品。,mRNA的提取,分离纯化完整的mRNA是进行分子克隆、基因表达分析的基础。,DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定,1 仪器测定 紫外分光光度计 ssDNA=33 （OD2600D310) 稀释倍数 dsDNA= 50（OD2600D310) 稀释倍数 ssRNA=40 （OD2600D310) 稀释倍数,核酸蛋白测定仪,DNA纯度的判断 A260/A280=1.8 1.9表明有RNA污染 1.6表明有蛋白质、苯酚等污染RNA纯度的判断 A260/A280 1.72.0 1.7表明有蛋白质、苯酚的污染 2.0表明有异硫氰酸胍残存,2 琼脂糖凝胶电泳鉴定,DNA电泳图谱,RNA电泳图谱,思考题： 1 提取RNA 过程中防止RNA酶污染所采取的措施是什么？ 2 如何根据A260/A280 的值判断DNA和RNA的纯度？,
