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1、抗体，抗体的多样性及其产生机制,抗体研究简史,20世纪有关抗体研究获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家,20世纪有关抗体研究获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家,Emil von Behring, 1901, antitoxins,Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody,Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene,Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody,Paul Ehrlich , 1908,
2、production of antibody,Nobel Prize winners,Burnet, 1960，Clonal selection,Jerne, 1984,Idiotype network,抗体生物体最奇妙的分子,无限的多样性（diversity)功能与结构的双重性 可变区抗原结合 ( 特异性specificity ) 恒定区生物学效应功能分泌型和膜型表达,B细胞接受抗原刺激后增殖分化成浆细胞产生的糖蛋白。,基本概念,主要存在于血清中。,Emil von Behring (1845-1917),抗毒素（1888）凝集素（1896,Gruber and Durham）沉淀素（189
3、7, kraus）抗体(antibody),是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白。,抗体一词的由来（19世纪末）,1937年 Tiselius和Kabat 用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动最慢的血清组分，称为球蛋白,抗体与球蛋白关系,抗体球蛋白,1968和1972年WHO和国际免疫学会分别决定将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白.,抗体与免疫球蛋白关系,Ig与Ab的关系,Ig是化学结构的概念，Ab 是生物学功能的概念。所有的Ab都是Ig，但Ig并非都有抗体活性。（以往认为）现在认为Ig=Ab,Ig,Ab,一、基本概念B细胞接
4、受抗原刺激后增殖分化成浆细胞产生的糖蛋白与相应抗原特异性结合主要存在于血清中又称免疫球蛋白 (Immunoglobulin)分泌型 sIg、膜型 mIg,1897年Paul Ehrlich 提出侧链学说1930年Haurowitz 提出直接模板学说1941年Pauling提出间接模板学说1955年Niels Jerne 提出自然选择学说1958年FM Burnet 提出克隆选择学说,抗体生成理论的发展史,人工制备抗体的发展简史,第一代抗体：多克隆抗体 (19世纪) （polyclonal antibody, PcAb）第二代抗体：单克隆抗体（1975年） （monoclonal antibod
5、y, mAb）第三代抗体：基因工程抗体（80年代中期） （genetic engineering antibody, GEAb）,1）四肽链通过链间二硫键组成H2L2重链：五类(isotype: a、g、m、d、e) 轻链：两型(k、l),一、基本结构,免疫球蛋白的结构,Rodney Porter 1917-1985Nobel Prize in 1972,Gerald Edelman 1929 -Nobel Prize in 1972,重链（Heavy chain:H链） 大约500 a.a, 糖基(+) 类别（Class ）:H链：, , , , . (Ig) IgA, IgG, IgM I
6、gD, IgE 轻链（light chain:L链） 大约214 a.a,糖基(-) 型别（ type）: ,重链和轻链（Heavy & light chains）,可变区(Variable region, VH/VL, Fv)：结合抗原 VH和VL： 高变区 HVR 抗原结合部位互补决定区CDR 骨架区 FR14 (1971, Kabat) 恒定区(Constant region, CH/CL) 绞链区(Hinge region),The basic structure of immunoglobulins,三个功能区(Domain),0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
7、 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220,5040 30 2010 0,CDR1,CDR2,CDR3,抗体分子的多样性,Igl 链 的 氨 基 酸 序 列,对来自不同B细胞克隆的Ig轻链氨基酸序列进行比较，发现V区的变化主要集中在3个分别由610个氨基酸残基组成的狭小区域内。这3个区又被称作高可变区或互补决定区（CDR），参与抗原结合部位的组成。,0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220,5040 30 2010
8、 0,CDR1,CDR2,CDR3,抗 体 分 子 的 多 样 性,Diversity and Specificity,抗原,B细胞表位,抗体 CDR,表位,铰链区（Hinge region）,特点：1)极富弹性2)富含脯氨酸功能:1) 有利于 Ab 与Ag的结合2)有利于 Ab 与补体的结合,IgG分子结合抗原前后的构象变化,结构域,1）Ig分子中由链内二硫键构成的致密立体球体(V/C/H)。 2）b-sheet、b-barrel、immunoglobulin fold。 3）CDRs(Hypervariable regions)、FRs(Framework regions)。,免疫球蛋白的
9、结构功能区,“Ig-like Domain (Ig样结构域)”,二、免疫球蛋白的其他成分,(1)化学本质：浆细胞分泌的多肽链,J CHAIN,IgA dimer,(2)存在：IgM（五聚体）, sIgA（双体）,IgM,连接链（joining chain，J链）,Secretorypiece,Joining chain,IgA dimer,分泌片（Secretory Piece，SP),(1) 化学本质： 多肽链(70kD),(2)来源：上皮细胞,J chain,（3）作用： a.帮助IgA穿越黏膜 b.保护s IgA抵抗蛋白酶的水解作用,Secretory IgA(sIgA),Plasma
10、cells,IgA dimer,pIgR,SP,Epithelial Cell,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,Fc,pFc,F(ab)2,Fab,三、免疫球蛋白的水解片段,木瓜蛋白酶作用于IgG分子重链间二硫键的N端侧，将其裂解为Fab段和Fc段。胃蛋白酶则切在该二硫键之C端侧，产生F(ab)2和pFc段。,类(Class): 重链C区抗原性IgG、IgA、IgM、IgD、IgE亚类(Subclass): 重链抗原性/二硫键数目位置IgG1-4型(Type): 轻链C区抗原性k、l亚型(Subtype): 轻链C区aa差异排列 l14,免疫球蛋白的异质性,免疫球蛋白的类型,血清型,免疫球蛋白既可结合抗
11、原，又可作为抗原，激发机体的免疫应答，因而也是一类抗原物质。由于免疫球蛋白的遗传基础不同，不同的免疫球蛋白的抗原性也有差异。利用血清学方法测定和分析免疫球蛋白抗原性予以分类，称为免疫球蛋白的血清型。,1、同种型(isotype)：同一种属所有个体免疫球蛋白分子共同的抗原特异性标志。 由C区决定 。,2、同种异型（allotype)： 同一种属不同个体间免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特异性标志。 由链、链、链、链C区决定。,3、独特型(idiotype,Id)： 每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志。由超变区特殊的氨基酸序列及其构型决定。,1）与相应抗原特异性结合：Fv2）激活补体：3）结
12、合FcR：促吞噬(opsonization) 介导过敏 介导细胞毒(ADCC) 免疫调理 4）穿过胎盘和粘膜5）调节免疫功能,免疫球蛋白的功能,免疫球蛋白的功能,a.,b.,免疫球蛋白的功能,FcR,Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用),Target cell,Ab,Effector cell,Target cell,表达Fc受体的组织细胞(NK、M、中性粒细胞）通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的的靶细胞。,ADCC,免疫球蛋白的功能,抗体的抗病毒效应,介导 ADCC,经典途径激活补体,调理吞噬作用,
13、免疫球蛋白的功能,IgG,IgM,IgA,IgE,IgD,各类免疫球蛋白的特点和功能,出生后3个月开始合成，35岁接近成人含量最多 占血清总Ig的 75%产生比较晚，是再次应答的主要抗体半衰期最长(t =23天)分布最广，血管外的主要抗体唯一能通过胎盘的Ig激活补体 IgG13（经典），IgG4（替代）结合细胞 巨噬细胞，单核细胞调理作用 NK细胞，巨噬细胞介导ADCC 结合SPA协同凝集实验,特性：,IgG,IgG,功能：,抗感染的主要抗体 介导 II,III型超敏反应介导自身免疫,调理 介导 ADCC 固定补体中和病毒和毒素,抗菌 抗病毒抗外毒素,IgG四个亚类的特点,IgG1,IgG2,
14、IgG3,IgG4,血清含量(占IgG的百分比） 70 20 6 4 血清半衰期(天) 23 23 7 23通过胎盘 + + + +固定补体 + + + 结合Fc受体 + + +,特性血清中含量第三出现最早的Ig分布局限，主要在血管内d) 通过经典途径激活补体e)分子量最大f)凝集细菌e) 结合细胞 巨噬细胞,单核细胞-调理 NK细胞,巨噬细胞-介导ADCC,IgM,J 链,IgM,抗感染的先锋抗体 介导 II,III型超敏反应 介导自身免疫天然血型抗体,调理作用 (最强 ) 激活补体中和病毒和外毒素 凝集微生物 介导 ADCC,功能：,抗菌作用最强 (5001000IgG) 抗病毒 抗外毒素
15、,IgA,特点:,血清中含量第二 (血清型 IgA，serum IgA)主要以分泌型存在( 外分泌液中）.(secretory IgA,sIgA) sIgA通过初乳被动转移给新生儿,唾液, 眼泪, 乳汁, 鼻黏膜, 支气管分泌液, 生殖 道分泌物, 前列腺液, 小肠黏膜分泌液.,SC,J chain,IgA dimer,sIgA,功能：,粘膜局部抗感染的主要抗体,阻止病原体粘附于粘 膜细胞中和病毒和外毒素,伤寒沙门氏杆菌, 奈瑟氏淋球菌 脊髓灰质炎病毒，流感病毒,抗菌作用 抗病毒作用 抗外毒素作用,IgD 分 子,*在膜表面的表达是B 细胞成熟的主要标志；*膜型IgD 作为BCR的组成部分，发
16、挥信号传导作用,Structure of IgE molecule,IgE,特性,1)含量最少,2)与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcR受体结合,亲细胞性抗体:不与Ag结合，即可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcR牢固结合,3)不能激活补体,IgE,参与过敏反应( I型超敏反应),结合肥大细胞 和嗜碱性粒细胞 导致各种生物活性的介质的释放,嗜酸性粒细胞有IgE的FcR，嗜酸性粒细胞通过此受体结合包被在蠕虫上的IgE的Fc段，最终杀死寄生虫,抗寄生虫感染,作用,人抗体分子的特性,抗体类别,IgG,IgA,IgM,IgD,IgE,重链类别,g,a,m,d,e,重链亚类,g1, g2, g3, g4
17、,a1, a2,轻链类别,k,和,l,k,和,l,k,和,l,k,和,l,k,和,l,分子式,g,2,l,2,或,g,2,k,2,a,2,l,2,或,(a,2,l,2,),5,SCJ,a,2,k,2,或,(a,2,k,2,),5,SCJ,(m,2,l,2,),5,J,或,(m,2,k,2,),5,J,d,2,l,2,或,d,2,k,2,e,2,l,2,或,e,2,k,2,分子量,（,kDa,）,150,160,或,400,900,180,190,固定补体能力,+,0,+,0,0,血清浓度,(mg/100ml),1000,200,120,3,0.05,血清半衰期,(,天,),23,6,5,3,2
18、,穿过胎盘,0,0,0,0,肥大细胞和嗜碱,性细胞脱颗粒,？,0,0,0,+,裂解细菌能力,+,+,+,?,?,抗病毒能力,+,+,+,?,?,抗体的多样性及其产生机制,抗体的多样性抗体的多样性产生的机制抗体的类别转换,（一）抗体的多样性,抗体/免疫球蛋白的基因结构抗体基因的重排抗体基因的重排机制,抗体的多样性早期假说一：生殖细胞学说,抗体的多样性早期假说二：体细胞突变学说,The genome contains many loci encoding antibody molecules.B cell express one of these loci.Different B cells ex
19、press different loci.,There are a small number of antibody genes which undergo mutation as the B cell matures , thus giving rise to B cells expressing antibody of different specificity.,1971年 Kabat基因嵌入模型,利根川进：抗体的基因重排理论,免疫球蛋白的基因结构,In heavy chains, the V, D and J segments encode the variable domain wh
20、ile the C segment encodes the constant domain.In light chains, the V and J segments encode the variable domain while the C segment encodes the constant domain.,抗体基因的重排,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearran
21、gement.,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.,The kappa and lambda loci undergo similar rearrangement.Since there are no D segments, there is a single V-J rearrangement.In both heavy and light chain
22、 rearrangement, a number of J segments mayremain between the V(D) and C segments.These are included in the RNA transcript but are spliced out during RNAprocessing.The final light chain mRNA contains one VJC unit.,Kuby Figure 5-4,Kuby Figure 5-4,抗体基因重排的机制,（1）重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)
23、,在VH和VL基因3端、J基因5端和D基因两端有高度保守的核苷酸序列，包括一个7核苷酸组成的七聚体(heptamer)和一个9核苷酸组成的九聚体(nonamer)，两者间隔121或231个核苷酸，称为RSS。,只有间隔12个碱基对和间隔23个碱基对的RSS之间发生重组，而间隔长度相等的RSS之间不发生重组，这就是12/23碱基对规律(12/23 base pair rule)，也叫做1+2圈规律(1+2 turn rule)。,Kuby Figure 5-3,Recombination signal sequences - conserved sequences in regions just
24、 upstream or downstream of gene segments.Consist of a conserved heptamer and nonamer with a 12 or 23 bp spacer.,Kuby Figure 5-3,The one-turn/two-turn rule (12/23 rule) - recombination occurs onlybetween a segment with a 12 bp spacer and a segment with a 23 bp spacer.,Recombination Signal Sequences D
25、irect Recombination,Recombination Activating Genes (encode RAG-1 and RAG-2)RAG-1 and RAG-2 mediate recognition of signal sequences and rearrangement of DNA segments.Mice deficient in RAG-1 or RAG-2 are unable to rearrange heavy or light chain genes.These mice have no mature B cells.- B cells will no
26、t mature if they cannot express a BCR.,（2）重组活化基因Recombination Activating Genes,RAG-deficient mice also lack mature T cells.- The T cell receptor is also encoded by loci containing gene segments that must be rearranged before the TCR can be expressed.T cells will not mature if they cannot express a T
27、CR.SCID (severe combined immune deficency) mice also have a defect that affects rearrangement of BCR and TCR loci.They also have no mature T or B cells.,Flow cytometry of normal vs. RAG-1 deficient mice:Lymph node cellsFITC anti-CD19 (B cell marker) and PE anti-CD3 ( T cell marker),Normal mice,RAG-1
28、 - deficient mice,How recombination in the V regions of antibody happens?,Terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt)An enzyme that randomly adds in nucleotides during joining of heavychain (NOT light chain) segments.,Read Kuby pages 113-115: Gene Segments Are Joined by Recombinases,Productive and n
29、onproductive rearrangementsJoining of segments is not precise and may result in loss of the correct reading frame.This may lead to introduction of stop codons - nonproductiverearrangements.,RSS,RSS,RSS: recombination signal sequenceRAG: recombination activating gene,P-核苷酸和N-核苷酸的加入,Two alleles are av
30、ailable at each locus (maternal and paternal).A B cell expresses only one heavy and light chain allele.- ALLELIC EXCLUSION,First, one allele of the heavy chain is rearranged.If the rearrangement is successful, the other allele will not be rearranged.If the rearrangement is nonproductive, the other a
31、llele will be rearranged.Once a heavy chain allele rearrangement is productive, light chain rearrangement will begin.If rearrangement of both heavy chain alleles is nonproductive, the B cell will not mature further but will die of apoptosis within the bone marrow.,If a heavy chain allele is successf
32、ully rearranged, light chain rearrangement begins.In humans, the kappa locus is rearranged first.Rearrangement occurs at one allele at a time and continues until a productive rearrangement occurs.If both kappa alleles rearrange nonproductively, rearrangement will begin at the lambda locus.If all 4 a
33、lleles (both kappa alleles and both lambda alleles) rearrangements are nonproductive, the B cell will not mature but will instead die of apoptosis within the bone marrow.,If either both heavy chain alleles, or all four light chain alleles, rearrange nonproductively, the B cell will not mature.,Allel
34、ic exclusion,Allelic Exclusion Ensures a Single Antigenic Specificity,组合多样性（combinatorial diversity）连接多样性（junctional diversity）体细胞高频突变（somatic hypermutation）,（二）抗体多样性产生机制,（1）组合多样性,包括多副本的V基因、D基因、J基因及轻链重链等随机配对所形成的多样性,以IgH为例，按50个VH基因、30个D基因、6个JH基因、40个V基因、5个J基因计算，固有多样性可达：503064051.8106,（2）接头处的变化所产生的多样性（
35、junctional diversity）,这种变化不依赖于抗原，发生在CDR3，包括重组时编码端核苷酸的删除、添加、P核苷酸和N区的形成等有些是在原有遗传信息基础上的变化，如接头处不准确连接所造成的编码框架的变化、D段阅读框架的变化、P核苷酸的形成等有些与基因DNA中携带的信息无关，如N区的形成估计CDR3的多样性可达1014,（3）体细胞高频突变（somatic hypermutation）,亲和力成熟过程中的体细胞突变仅发生于重组后的可变区基因及其3端和5端300个左右碱基以内，而不见于恒定区，主要是点突变，也可能有插入和缺失，相当于“微调”突变率比细胞中正常基因高数百万倍发生在生发中心
36、（germinal center）,抗体分子的多样性,（三）抗体类别转换(class switch),抗体分子的类别转换,m,d,g3,V,J,g3,D,V,J,D,Primary transcript,V-D-J,m,mRNA,Primary transcript,V-D-J,g3,mRNA,m,d,Lost genes,IgM,maturation,IgG,IgG,IgM,primary antigen,secondary antigen,antibody response,primary response,secondaryresponse,time,（Class-switching）,Thank you !,
