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1、,激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用,1,2,CTC 染色,Baclight Live/Dead 染色,Baclight Live/Dead 染色,激光扫描共聚焦显微成像,3,主要内容,1、分子荧光的形成2、微生物研究中常用的荧光染料3、共聚焦显微镜基本原理4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用,4,一、分子荧光的产生,1.1 分子荧光产生的条件1. 基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至激发态, 通常为*、n*跃迁2. 激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光）,5,6,1.2 影响荧光的因素1. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的
2、极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化2. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制,7,二、微生物研究中常用的荧光探针,荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类,8,1、膜通透性（membrane integrity）2、代谢活性(metabolic activity)3、膜电位(membrane potential)4、酯酶活性(esterase activity)5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它,微生物研究中主要的荧光探针：,9,1、膜通透性(membrane int
3、egrity) BacLight Live/Dead (PI/SYTO9),PI,PI,PI,PI,PI,PI,SYTO9,SYTO9,SYTO9,PI,PI,PI,PI,PI,Viable cell,Damaged cell,SYTO9,SYTO9,10,链霉菌不同发酵时期：菌丝活性及内部结构,Example 1. Staining of Streptomyces sp. with BacLight live/dead L7007,11,2、代谢活性(metabolic activity),微生物代谢活性分析的荧光探针主要有：5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium c
4、hloride (CTC) 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2-tetrazolium bromide (MTT)2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide (INT),12,红色荧光分子,无色非荧光分子,Viable cell,CTC的微生物细胞还原,CTC,CTF,CTF,13,Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC,CTC 染色,CTC 染色,14,3、酯酶活性(esterase activity),
5、工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保留于胞内1. Fluorescein diacetate (FDA)2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE),15,荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子,活性微生物细胞,活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于微生物细胞内,16,4、膜电位（membrane potential）,工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位，可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标1. 带正电荷荧光探针Rhodamine 123 (
6、Rh123); DiOC6(3)进入活性细胞2. 带负电荷荧光探针Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol DiBAC4(3)进入死细胞,17,5、pH荧光探针,工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH梯度，因此，测定微生物细胞内的pH可作为细胞生理状态的一个评价标准1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)2. Pranine3. BCECF,18,一些常见荧光染料的激发与发射波长,19,三、激光扫描共聚焦显微镜,3.1 激光扫描共聚焦显微镜
7、的组成显微镜光学系统扫描装置激光光源检测系统 整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。,20,3.2 共聚焦成像原理,21,22,More Color Possibilities,2. Less Cross Talk（串色）,3.3 激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较,23,4. Three-Dimensional Reconstruction of Specimen （三维重构）,5. Improved Resolution（更高的分辨率）,3. Optical Sectioning of Objects Without Physical Con
8、tact （光学切片）,24,25,Example 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy,Fluorescent microscopy,Fluorescent microscopy,Confocal microscopy,显示的是一个光学切面,26,样品的3D-重建,27,激光扫描共聚焦显微镜主要功能,1、荧光定性2、荧光定量3、动态荧光监测4、断层扫描5、三维重构6、共聚焦图像分析7、荧光显微切割,28,四、激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用,4.1 共聚焦在链霉菌研究中的应用1、发育分化的研究
9、2、内部结构及活性研究3、菌体大小测量4、产物合成的研究,29,链霉菌Streptomyces antibioticus 的生长分化,30,4.2 共聚焦在真菌研究中的应用1、真菌浸染机制的研究2、真菌发育分化的研究3、真菌生长的研究4、真菌活性的研究（FDA/PI）5、真菌的原位研究6、真菌细胞融合的研究7、一些机制的研究，如胞吞等,31,4.3 微生物的群落分析1、环境中微生物的分布及活性的原位分析（光学切片功能）2、食品污染分析,32,1、荧光原位杂交研究（In situ hybridization）2、生物膜的研究(bioflim)3、细菌在植物根部的定植研究4、细菌的活性分析5、抗菌分析,4.4 共聚焦显微镜的其它相关的研究,33,实验：激光扫描共聚焦显微基本步骤,1、选择荧光探针：主要依据实验目的，选择好荧光探针，目前，荧光探针的种类已经成千上万，人们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。2、样品染色：染色时间长短与染料及微生物有关，短的几分钟3、制片：与普通显微镜类似，制片后尽快观察4、上机观察：仪器参数设置,34,感谢您的关注！欢迎相互交流！,35,
