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1、第十四章 细胞增殖调控与癌细胞,第一节 细胞增殖调控,本节内容,一,二,三,五,MPF的发现及其作用,34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系,周期蛋白,CDK和CDK抑制因子,细胞周期运转调控,四,六,其他因素在细胞周期调控中的作用,一、MPF的发现及其作用,1,2,科学家通过三个实验找到并证实了MPF,MPF的功能,时间,研究者,步骤,1970,Rao和Johnso,将HeLa细胞同步于不同阶段，然后将M期细胞与其他间期细胞融合,实验一,M期细胞可以诱导PCC,结果,在M期细胞中可能存在一种诱导染色体凝集的因子，称为细胞有丝分裂促进因子。,结论,HeLa细胞,G1期,S期,G2期,仙台病毒
2、介导,早熟染色体凝缩（PCC）,同步化,M期细胞,A： G1期DNA未复制，超前染色体为单线性；B：S期DNA正在复制，超前染色体为点状，很多复制起始点；C：G2期DNA复制完毕，超前染色体为双线性。,时 间,步 骤,1971,Masui和Markert,实验二,孕酮诱导成熟的卵母细胞的细胞质能诱导其他卵母细胞的成熟,结 果,在成熟的卵母细胞中，必定有一种物质，能诱导卵母细胞成熟，这种物质称为成熟促进因子（MPF）,结 论,用解剖的方法分离非洲爪蟾第IV期卵母细胞，孕酮诱导成熟后进行细胞质移植实验,研究者,卵细胞细胞质移植实验,成熟卵母细胞中的物质能诱导卵母细胞成熟,以爪蟾卵为材料，纯化MPF
3、工作,时间,步骤,1988,Maller et al,实验三,MPF组成：p32和p45两种蛋白。p32和p45结合后，表现出蛋白激酶活性，能使多种蛋白质底物磷酸化,结果,MPF（又称细胞促分裂因子或M期促进因子），是由细胞周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶组成的复合物，能启动细胞进入M期。,结论,研究者,二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系,1,2,酵母中cdc基因的发现,cdc激酶与MPF的关系,以裂殖酵母为实验材料，构建温度敏感型突变株，分析突变株基因改变情况,时间,步骤,1970,Nurse等,实验一,找到cdc基因，如cdc2,表达蛋白为34kDa,称为p34cdc2,结果,
4、第一个被分离出来的cdc基因，表达蛋白为34kDa，称为p34cdc2。特点：突变后芽殖酵母细胞停留在G2/M期,结论,研究者,以芽殖酵母为实验材料，构建温度敏感型突变株，分析突变株基因改变情况,时间,步骤,1960,Hartwell,实验二,找到cdc基因，如cdc28,表达蛋白为34kDa,称为p34cdc28,结果,第二个被分离出来的cdc基因；突变后细胞停留在G1/S或G2/M期 。,结论,研究者,cdc28: 第二个被分离出来的cdc基因，表达蛋白为p34cdc28特点：突变后芽殖酵母细胞停留在G1/S或G2/M期,cdc2: 第一个被分离出来的cdc基因，表达蛋白为p34cdc2特
5、点：突变后裂殖酵母细胞停留在G2/M期,共同特点：1. 大小相等，是同源物，并且与MPF中的P32是同源物2本身都不具激酶活性，只有与特定蛋白结合后（ p56cdc13 ） 才有激酶活性,MPF=p34cdc2(p34cdc28)+ p56cdc13 (cyclinB),Leland H. Hartwell,R. Timothy (Tim) Hunt,Sir Paul M. Nurse,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,cdc28,周期蛋白,cdc2,三、细胞周期蛋白,特点
6、：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导与CDK结合。作用：激活和引导CDK作用于不同底物。已知30余种，分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。,PEST序列与G1期周期蛋白更新有关,周期蛋白框：介导与不同CDK结合,破坏框：将泛素（遍在蛋白）连接到破坏框上,G1期周期蛋白：只在G1期表达，只在G1期和S期转化过程中执行调节功能。种类： cyclin C、D、E、Cln1、Cln2、Cln3举例： 在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，释放转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyc
7、linE、A和CDK1的基因。,M期周期蛋白：在间期表达和积累，到M期时才表现出调节功能。种类：cyclinA、cyclinB举例： cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1引起染色体凝缩、核膜解体等。,不同的周期蛋白与不同的CDK结合，调节不同的CDK激酶的活性。,CDK （ cyclin-dependent kinase） （1）CDK的种类 （2）CDK的分子结构CDK抑制因子,四、CDK和CDK抑制因子,通过PCR技术构建人类、非洲爪蟾、果蝇cDNA文库，并对其筛选。 分离到10多个cdc2同类基因，不同物种的cdc2基因编码的蛋白质都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白
8、结合，将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性。它们被统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase)，简称CDK。 已经发现CDK1-CDK13等CDK激酶。,1、CDK,（1）与不同类型的周期蛋白相结合的CDK,*包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,(2)不同类型的CDK/cyclin复合物及其参与的细胞周期调控,可能与周期蛋白结合有关,（2）CDK的分子结构,不同物种的cdc2基因编码的蛋白质都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白结合，将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性，被统称为CDK。,CDK抑制因子（CDKI）
9、：对细胞周期起负调控作用，分为：INK4家族: p16为典型代表，主要抑制CDK4和CDK6活性。Cip/Kip家族：p21为典型代表，主要对G1期CDK（ CDK2、 CDK3、 CDK4和CDK6）起抑制作用。还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。,2、CDKI,五、细胞周期运转调控,细胞周期中的检验点,G1/S检验点：检查DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？ S期检验点：DNA复制是否完成？ G2/M检验点：检查DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期检验点（纺锤体组装检验点）,cell cycle regulation,1、CDK1激
10、酶,Cdc2蛋白：在细胞周期中，含量相对稳定。周期蛋白B：G1期晚期开始合成，G2期达最大值。 周期蛋白B含量达到一定程度，CDK1激酶活性始现，到G2晚期， CDK1激酶活性最大。,（一） G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用,（一） G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用,cyclinB在CDK1激酶活性调节中的作用,CDK1激酶使某些蛋白质磷酸化，改变其下游的某些蛋白质的结构和启动其功能，实现调控细胞周期。例如：组蛋白H1磷酸化：导致染色体的凝集；核纤层蛋白A、B、C磷酸化：导致核纤层解体、核膜消失；核仁蛋白磷酸化：导致核仁解体。,2、CDK1激酶活性的调控,先决条件：周期
11、蛋白与CDK结合修饰：对一些重要位点进行磷酸化修饰，对CDK激酶活性起重要调节作用。,CDK1激酶活性的综合调控 （教材p305）,（二） M期周期蛋白与分裂中期向后期转化,细胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋白B/A 与CDK1分离，在APC介导下，通过泛素化途径而降解。 CDK1激酶活性丧失，蛋白质（ CDK1激酶磷酸化的）去磷酸化，细胞周期由中期向后期转化。,在分裂中期，当MPF活性达到最高时，激活后期促进复合物APC，将泛素连接在cyclin B上，cyclinB被蛋白酶体降解，完成一个细胞周期。M期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称破坏框(destruction box)。泛素由
12、76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。,APC活性调节：两类正调控因子：cdc20/Fizzy, cdh1/Fzy等负调控因子：Emi1, Emi2, Mad2, BubR1等,APC种类：15种，如cdc16, cdc23, cdc27和BimE等,泛素与周期蛋白的降解：多聚泛素化作用(polyubiquitination)泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, E1) 泛素结合酶(ubiquitin-conjuga
13、ting enzyme, E2) 泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3),APC的活性调节控制周期蛋白B的降解当MPF的活性在有丝分裂中期达到最高峰时, 它被CDK所激活，即APC磷酸化后被激活；接着发生周期蛋白B遍在蛋白多聚化, 引起周期蛋白B的降解；由于周期蛋白B是MPF的一个必需亚基, 它的降解势必导致MPF的失活；在G1期的后期,APC失活,使得周期蛋白B的浓度升高,同时提高MPF的活性, 以便进入下一个有丝分裂期。,（三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK,G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb蛋白（
14、成视网膜细胞瘤蛋白）磷酸化而失活，释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞进由G1期向S期转化，并直接参与中心体复制与调控。TGF抑制cyclinE-CDK2的活性使细胞抑制在G1期。CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期。CDK2催化p107磷酸化，释放E2F。在S期，cyclinA与CDK2结合为S期的主要激酶，参与DNA复制，使复制因子RF-A磷酸化而活性增强。,G1期周期蛋白降解通过SCF（Skp-cullin-F-box protein）泛素化途径实现。G1期周期蛋白不含破坏框序列，而含
15、PEST序列，对G1期周期蛋白降解起促进作用。参与复制的调控因子，如p21, p27和p57等通过泛素化途径降解。SCF具有E3泛素连接酶的功能，由Skp1, Cul1和Rbx1三种亚基构成。SCF的底物特异性由F-box蛋白决定。,APC和SCF在细胞周期中的活性及其底物,SCF泛素化依赖蛋白降解途径,DNA复制活动调控复制起始点识别复合物：6个亚基，ORC1-6cdc6 和cdc45也是复制所必需的“DNA复制执照因子学说”：存在于细胞质中，随细胞分裂进行，“执照”信号与减弱直到消失。 DNA复制执照因子的本质为Mcm蛋白，分为6种,（四） S/G2/M期转换与DNA复制检验点,包括S期内
16、部检验点和DNA复制检验点。S期内部检验点通过染色体结构维持蛋白SMC1磷酸化实现（ATM-MDC1-MRNC等中介物的系列催化过种实现），或通过ATM/ATR介导的cdc25A磷酸酶过磷酸化而降解。复制检验点由ATR/CHK1激活实现。 ATR/CHK1介导cdc25A降解，抑制cyclin E/A-CDK2通路。,DNA damage checkpoint: Cell-cycle progression is blocked by DNA damage and p53,How DNA damage arrests the cell cycle in G1.,有两个这样的限制点:1.一个在晚
17、G1期: 阻止进入期;2.一个在晚G2期: 阻止进入期;P53: 基因调控蛋白.DNA破坏通过间接机制激活p53。 Mdm2 作为ubiquitin ligase起作用，导致p53用于蛋白酶体（proteasomes）引发的降解. P53磷酸化降低了对Mdm2的连接.P21(CKI protein) 结合到 G1/S-Cdk和S-Cdk，抑制其活性，因而 阻断了期进入期.,生长因子是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖。作用方式：旁分泌。信号通路：ras、cAMP、磷脂酰肌醇途径。,如通过ras途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核内，激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclin D、SCF、E2F等G1-S有关的基因表达，细胞进入G1期。,Current model for regulation of the eukaryotic cell cycle,总结,1.简述p34cdc2/cyclin B 蛋白激酶的发现过程。2.细胞周期中有哪些主要检验点？3.举例说明CDK激酶在细胞周期中是如何执行调节功能的。,思考题,
