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1、2022/11/29,1,细胞培养涉及的基本知识,2022/11/29,2,最常见的两种生长型细胞,贴壁依赖性细胞(Anchorage-dependent cells) 贴附于不起化学作用的物质(玻璃、或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持。悬浮培养细胞(Suspension culture) 细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。,2022/11/29,3,细胞培养中常用的几个术语,细胞系(Cell line)： 原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。 连续传代 连续传代 连续细胞系 有限细胞系 (已建成的细胞系),2022/11/29,4,细胞株(Cell strain): 由具有某
2、些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系。细胞周期(Cell cycle) 细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。 4个时期：S期：DNA合成期 M期：有丝分裂期 G1期：有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期 G2期：DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期 G0期：某种原因导致细胞不再沿周期进行，进入 休眠状态,2022/11/29,5,细胞一代时间(Cell generation time) 单个细胞两次连续分裂的时间间隔。群体倍增时间(Population doubling time) 在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所 需要的时间。,2022/11/29,6,克隆(Cl
3、one) 单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。细胞融合(Cell fusion) 体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞(Hybrid)。细胞汇合(Confluence) 器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层。,2022/11/29,7,原代培养(Primary culture) 从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的 培养。传代培养(Passage)(Subculture) 细胞从一个培养器皿转移至另一个培养器皿 中培养。再培养(Reculture) 单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基 中的过程。,2022/11/29,8,集落形成率(
4、Plating efficiency) 细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百分率。 单个细胞 集落 克隆形成率(Cloningefficiency)群体密度(Population density) 培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数(细 胞数/cm2)。饱和密度(Saturation density) 特定条件下，培养器皿中能达到的最高细胞数 (细胞数/cm2或细胞数/cm3)。,2022/11/29,9,培养基,培养基 天然培养基 合成培养基 基本培养基(通用培养基)(MEM ) 无血清培养基 无蛋白培养基 血清基本培养基(通用培养基) 完全培养基,2022/11/29,10,基本培养基
5、的组分 四大类物质 无机盐 氨基酸 维生素 碳水化合物 pH指示剂 酚红,2022/11/29,11,常用基本培养基 RPMI 1640 应用最广泛 DMEM 高糖型 4500g/L 葡萄糖， 低糖型 1000g/L葡萄糖 HamF12 无血清培养基常用的基础培养 基 199 ,2022/11/29,12,培养基的选择 培养细胞的首选培养基 常用培养基 根据细胞株特点、实验需要选择 用生长曲线、集落形成率等指标选择,2022/11/29,13,培养基配制时的注意事项 严格按说明书要求添加必要成分 NaHCO3 谷氨酰胺 HEPES - 各成分顺序溶解 配制培养基用水、器皿 灭菌 分装、保存,2
6、022/11/29,14,培养基添加成分 NaHCO3 一般按说明书要求添加 封闭式培养用5.6%或7.4%液调节 谷氨酰胺 易降解，使用前添加 使用终浓度0.002mol/L HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸) 主要作用为防止培养基pH迅速变动 使用终浓度0.01- 0.015mol/L,2022/11/29,15,完全培养基的添加成分,牛血清 小牛血清：取自出生1030天的小牛。 新生牛血清：取自出生24小时之内的新生牛。 胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿刺方 法获得。,2022/11/29,16,血清的主要作用 提供细胞生长所需的基本营养物质。 (激素、生长因子、结合蛋白) 提供贴壁和扩
7、展因子 (纤连蛋白,层粘连蛋白)。 对培养中的细胞提供保护作用。 抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作用 终止贴壁细胞消化传代中所用胰蛋白酶的作用 血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所受的机 械损伤,2022/11/29,17,使用血清的缺点 改变细胞在体内的正常状态 促进某些细胞生长同时抑制另一类细胞生长。 所含物质对细胞生长的影响或毒性作用 批间成分的一致性 支原体、病毒的潜在污染性,2022/11/29,18,血清质量的判断 质量鉴定报告 理化性质 微生物检测 促生长效果(培养细胞检测) 克隆形成率、贴壁率测定 连续传代培养 外观判断 透明清亮 土黄色或棕黄色 无沉淀或及少量沉淀 较
8、粘稠,2022/11/29,19,血清的使用与贮存 灭活处理: 56水浴, 30分钟(去除补体) 贮存条件: 分装 -20 长期贮存, 避免反复冻融 4 , 1个月 融化步骤: -20 4 室温 使用浓度: 5%20%, 常用10% 临用前添加于培养基中,2022/11/29,20,无血清培养基,用途 观察生长因子对细胞的作用,需排除其它生长因子的干扰作用 测定细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力 大规模培养细胞，获得分泌产物,2022/11/29,21,无血清培养基的组成 基础培养基 HamF12 : DMEM = 1 : 1 添加组分 促贴壁物质（细胞外基质，如纤连蛋白,
9、层粘连 蛋白） 促生长因子及激素 酶抑制剂（终止胰酶消化作用，保护细胞，如大 豆胰酶抑制剂） ,2022/11/29,22,更换无血清培养基的注意事项 针对性强 直接适应 连续适应 逐步降低血清浓度,2022/11/29,23,无蛋白培养基(PFM) 不含动物蛋白的培养基，以添加植物水解物替代动物激素、生长因子。 用途 生物技术产品生产,2022/11/29,24,限定化学成分培养基(CDM) 培养基中所有成分明确，不含动物蛋白，也不添加植物水解物，而使用一些已知结构与功能的小分子化合物(短肽、植物激素等)。用途 分析细胞分泌产物,2022/11/29,25,细胞培养中的其它用液 平衡盐溶液
10、PBS Hanks液 D-Hanks液 -,2022/11/29,26,消化液 胰酶溶液(0.10.25%) D-Hanks液配制 最佳pH值：89 EDTA溶液(0.02%) 用于解离细胞(破坏细胞间的连接) 与胰酶混合用于消化贴壁牢的细胞 胶原酶溶液(0.10.3mg/L) 不易损伤细胞，不受Ca2+ 、Mg2+及血清抑制,2022/11/29,27,细胞培养的生长测定,血细胞计数法 细胞密度(个/ml)=平均细胞数104 稀释倍数 影响方法精确性的因素 贴壁细胞消化的时间 细胞悬液的均匀性 细胞浓度合适,2022/11/29,28,台盼蓝染色法 正常细胞不染色，死亡细胞呈蓝色。 细胞活力
11、(%)=(总细胞数-着色细胞数) 总细 胞数100% 注意 为一种粗略的检测存活细胞的方法， 不能准确放映细胞活力差异。 判断时间,2022/11/29,29,MTT比色法 活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮 唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积 于细胞中。用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于 酶标仪上测定光吸收值。紫色不溶性结晶物形 成的多少与活细胞数目和功能状态相关。 细胞存活率=试验组光吸收值对照组光吸收值100% MTT法特点 高浓度血清的影响 简便迅速。 不接触同位素，敏感性与同位素法接近。,2022/11/29,30,细胞生长曲线法 可观察同一代细胞的增殖过程。根据生长曲
12、线分析细胞增殖速度，确定具体实验细胞传 代的最佳时间。 方法 总培养时间7天 计数每24小时细胞数目 绘制细胞生长曲线 潜伏期 原代细胞24-96h 传代细胞6-24h 对数生长期 3-5d 倍增时间 停滞期,2022/11/29,31,3H-TdR掺入法 3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞新合 成的DNA 中，通过测定3H放射性脉冲数，计 算细胞的增殖活性。 特点 被标记的细胞为S期细胞， 3H-TdR掺入量放 映DNA合成的快慢。 放射性损害。 需要特殊实验室和特殊设备。,2022/11/29,32,细胞培养中的传代换液问题,原代培养后的第一次传代 原代培养方法 细胞活性 细胞类型和特点
13、 接种密度 培养条件常规传代 传代时间 对数生长期 传代比例 原瓶细胞分于2-4瓶 贴壁细胞酶充分消化,2022/11/29,33,二. 角质形成细胞培养问题,2022/11/29,34,角质形成细胞培养方法 组织块培养法 3T3细胞为滋养层培养法 胶原为滋养层培养法 气液交界面培养法 无血清培养法,2022/11/29,35,组织块培养法 将表皮块贴附在培养瓶壁上, 角质形成细胞逐渐从组织块边缘爬行长出。 特点 稳定可靠 获得的细胞数量有限 细胞生长周期长 成纤维细胞污染,2022/11/29,36,3T3细胞滋养层培养法 3T3细胞经丝裂霉素C或-射线预处理(失去分裂增殖功能)后, 低密度
14、接种在培养瓶壁上, 再将角质形成细胞种植在此细胞滋养层上。 3T3细胞 小鼠胚胎瘤成纤维细胞株 滋养层作用 促使角质形成细胞的贴附和生长,并形成集落,最后融合成复层鳞状上皮 接触性抑制成纤维细胞生长,2022/11/29,37,3T3细胞促进角质形成细胞粘附和生长的途径: 产生基质成分,促进角质形成细胞贴壁。 分泌促进角质形成细胞有丝分裂的活性因子。 通过细胞间相互作用,调节与角质形成细胞增殖相关的生 物因子。,2022/11/29,38,3T3细胞滋养层培养法特点 细胞接种密度低、增殖速度快且细胞生长稳定。 3T3细胞逐渐被挤压,随着角质形成细胞集落不断扩大形成冠状,然后被压缩成条索状,最后
15、脱落且消失。 3T3细胞培养过程中会分泌异种蛋白和抗原,用它作为滋养层培养的人角质形成细胞或人工表皮,移植后可能引起异种排斥反应。 培养过程中角质形成细胞角化明显。 改进法：向培养基中加入表皮生长因子、能增加细胞内 cAMP水平的试剂（霍乱毒素等）。,2022/11/29,39,胶原滋养层培养法 角质形成细胞的贴壁率 玻璃培养瓶 2.8%7%, 塑料培养瓶 14% 预铺胶原的塑料培养瓶 70%80%,2022/11/29,40,胶原促进角质形成细胞粘附、生长的机制 细胞外基质的主要成分,促进细胞贴壁。 覆盖培养瓶壁上不利于角质形成细胞粘附、 生长的化学基团。 为角质形成细胞提供粘附所需的特异性
16、化学基团。 为角质形成细胞的生长提供必要营养。,2022/11/29,41,气液界面培养法 使表皮细胞在更接近正常人体的生理状态下生长和分化。 培养皿内加上一层铺垫,再将皮肤角质形成细胞接种其上, 加入的培养液不超过铺垫水平,细胞通过铺垫吸收营养维持其生长发育。(接种在铺垫上的细胞先进行浸泡性培养，一定时间后铺垫支架升到气-液界面继续培养，使角质形成细胞完成终末分化。),2022/11/29,42,铺垫 动物或人的尸体的皮肤真皮 玻璃纤维片 胶原膜或尼龙网 胶原膜和尼龙网的贴合物。 Transwell培养皿特点 能培养出多层类似正常皮肤的细胞层次，与正常皮肤非常接近。,2022/11/29,4
17、3,无血清培养法 含血清的传统培养方法特点 必须在培养液中加入一定比例的血清以利于 细胞生长,但所含因素变化大,不明因素多,成份 复杂。 影响角质形成细胞生理和病理生理等的精细 研究(对表皮细胞的生长调节机制,培养表皮细胞因子的释放,特殊抗原和受体的表达研究等)。,2022/11/29,44,无血清培养法特点 技术要求较高。 培养基中需添加牛脑垂体提取物(WBPE)或猪脑垂体提取物(PWPE)。 排除了复杂的血清成分对人角质形成细胞的 不利因素影响。 为角质形成细胞培养的发展趋势。,2022/11/29,45,MCDB153无血清培养基 角质形成细胞培养基。 适用于低密度接种的传代表皮细胞的生
18、长,但 原代培养时细胞克隆形成率较低,不能满足较高 密度细胞生长的需要。 细胞以单层方式向外生长,但细胞之间缺乏桥粒 连接,不能形成表皮皮片。 培养液中的牛脑垂体提取物或猪脑垂体提取物 价格昂贵，疯牛病的危险。,2022/11/29,46,角质形成细胞无血清培养基(DKSFM,Gibco ) 去除牛脑垂体提取物。 保留对角质形成细胞的促生长作用,同时抑制成纤维细胞生长。 角质形成细胞贴壁快,增殖迅速,细胞长满单层后,呈现出典型的铺路石状,细胞呈多角形。 细胞免疫组化染色抗角蛋白抗体染色阳性。 整个培养周期中,角质细胞呈现出基底细胞形状,细胞表面没有分泌物。 操作简便易行,安全适用,避免了以胶原
19、或3T3细胞为滋养层法的缺点。,2022/11/29,47,影响角质形成细胞培养的因素皮肤标本的来源 正常人外科包皮环切手术弃之皮肤 标本运输和保存 无菌容器 短时间存放于平衡盐溶液,长时间存放于营 养液中。 标本预处理 清洗、去除组织、剪切,2022/11/29,48,表皮和真皮的分离 胰蛋白酶 分离基底细胞和上面的细胞。 既破坏桥粒又破坏半桥粒结构。 消化时间过长,丢失部分基底细胞。 消化时间过短,表皮和真皮分离不完全,混有 成纤维细胞。,2022/11/29,49,中性蛋白酶 主要分解IV型胶原和纤维粘连蛋白。 作用于表皮和真皮的结合处。 只破坏半桥粒结构。 获得的角质形成细胞活力较高,
20、增殖迅速,融 合成片的速度快。减少成纤维细胞污染。 可获得含有完整基底层细胞的表皮。 Dispase(GIBCO) 中性蛋白酶分离表皮和真皮,再用胰蛋白酶消化表皮成为单个的细胞。,2022/11/29,50,培养液中主要的添加物 胰岛素 氢化可的松 三碘甲状腺原氨酸 霍乱毒素 转铁蛋白 表皮生长因子 ,2022/11/29,51,主要添加物的作用 促进细胞的葡萄糖和氨基酸的吸收。 促进细胞的粘附和增殖。 促进细胞的合成代谢。 提高细胞内第二信使cAMP水平。 降低铁离子对细胞的毒性。 促进角质形成细胞的有丝分裂。,2022/11/29,52,钙离子浓度 与表皮细胞体外培养的多层化有关,钙离子
21、浓度低至一定浓度时,细胞的分层现象消失。 低钙 (0.050.15mM)时角质形成细胞不分化, 细胞增殖最佳; 当钙离子浓度上升到1.0mM时, 角质形成细胞发生分化, 显示生长。,2022/11/29,53,角质形成细胞株(系)应用 COLO-16株 来自于鳞状上皮癌的人角质形成细胞。 HaCaT株 永生化的正常人皮肤角质形成细胞(140 代)。,2022/11/29,54,三. 细胞培养技术在皮肤病相关领域中的应用,2022/11/29,55,微载体培养 细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。 特点 不增加培养容器表面积或培养基容积的前提下 提高培养表面积
22、。 省却了容器等的清洗和准备工作。 细胞与培养液的分离简单。 减少繁复的操作步骤,降低污染率。 提高产率。 微载体制作材料的进展 葡聚糖 纤维素 聚乙烯和二氧化硅, 聚苯乙烯 明胶,2022/11/29,56,在化妆品功效研究中的应用,传统皮肤细胞培养方法的应用 单层的培养技术-皮肤组织获取和化妆品研发 培养黑素细胞-美白化妆品活性成分筛选 朗格罕细胞、和淋巴细胞共同培养 -体外筛选化妆品过敏作用 富含Merkel细胞的表皮细胞悬液培养 -局部应用药物的耐受机制研究,2022/11/29,57,成纤维细胞的培养 -抗衰老化妆品活性成分开发中应用(筛选中 草药有效成分的抗衰老活性) -化妆品生理
23、功效研究中应用,2022/11/29,58,皮肤细胞的“三维培养” 器官型培养(气-液体交界面培养) 分离、培养皮肤的,使其在体外扩增, 然后将其接种于真皮类似物上, 暴露于空气中, 使表皮正常分化, 形成类似天然表皮的复层组织(体外重建表皮)。 真皮类似物 去表皮真皮 胶原基质 惰性材料 应用 真皮类似物和重建表皮的组合形成具有表皮和真皮 的简化的人皮肤。 用成纤维细胞研究从表皮透过的化妆品活性物质的 生物学效应,了解表、真皮之间的相互作用。 将其他细胞(内皮细胞、白细胞)引入真皮类似层,扩大测试系统 的使用范围。,2022/11/29,59,皮肤器官培养 活体皮肤于体外培养，并使其保持其一
24、定的结构和功能 。 培养方法 液体浸没的皮肤器官培养 气-液面交界的皮肤器官培养 应用 化妆品对皮肤急性刺激毒性研究,2022/11/29,60,在化妆品研发中的应用 延缓皮肤衰老化妆品 以皮肤和成纤维细胞为受试对象,寻找或筛 选具有抗衰老活性物质 ,确定该物质基本毒性情 况。 (观察对两种细胞增殖能力及活性的影响) 研究外界因素对皮肤的药理学或毒理学作用。 (如、药物及化妆品等) 将损伤作用作为模型进行化妆品的干预研究,2022/11/29,61,皮肤美白产品 将活的黑色素细胞引入重建真皮类似环境，作为体外皮肤美白剂的初筛模型。 光生物学研究, 如防晒剂的效果评价。,2022/11/29,6
25、2,化妆品配方及成品的毒理学研究 单层皮肤细胞培养 外来化学物的代谢及最初的刺激和过敏 反应。 皮肤三维培养 化妆品的细胞毒性、有效性研究及局部 应用化合物(药用化妆品、表面活性剂、渗 透剂和杀菌剂等)效果评价。,2022/11/29,63,毛发用化妆品 以毛根鞘上皮细胞为对象, 进行护发活性物质的筛选以及毛发用化妆品毒性测试研究。,2022/11/29,64,基础研究 皮肤三维培养(重建表皮、真皮类似物) -化妆品和洗护发产品对人体皮肤的刺激性 研究 -重建表皮可用于研究表皮终末分化以及研 究表皮细胞分化调节物、表皮对刺激反应 机制；化妆品经皮吸收和化妆品对屏障功 能的保护作用 -真皮类似物
26、用来研究真皮层的组成及生理 功能 -重建表皮+真皮类似物共培养系统用来研究 皮肤生理代谢、化合物的光毒性、效 应和防晒剂的作用,2022/11/29,65,体外细胞培养模型 角质形成细胞 黑色素细胞 朗罕氏细胞 成纤维细胞 皮脂细胞,2022/11/29,66,细胞培养评估方法及指标 评估目的 细胞模型 评估指标 毒性 2,3-细胞培养 细胞形态, 细胞活性 (中性红MTT,LDH,PEG2) 美白 黑素细胞培养 黑素的生成 黑素细胞和 酪氨到酶活性 角朊细胞共培养 3-细胞培养 抗衰老 成纤维细胞培养 细胞增殖, 胶原蛋白, 角朊细胞培养 弹性蛋白, 3-细胞培养 粘多糖等的生成,2022/
27、11/29,67,在基因工程药物血药浓度测定中的应用,特定依赖细胞株培养法 以药物对特定依赖细胞的增殖或抑制、细 胞数目的增减为量效指标。 细胞增殖法 : 促进特定依赖细胞株增殖, 抑制增殖法: 抑制细胞增殖,2022/11/29,68,细胞培养量效指标的测定方法 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(3H-TdR) 59Fe核素标记法 四氮唑盐法(MTT) 直接计数法 其他间接法,2022/11/29,69,细胞毒性的观察方法 放射性同位素摄入法 3H-胸腺嘧啶- 3H-亮氨酸-培养基中掺入3H-亮氨酸，根据 3H-亮 氨酸在细胞内含量测定细胞内蛋白质合 成情况 。 同位素法特点 揭示细胞分子水平的
28、动态变化,是研究细胞代谢 状态的重要手段。 放射性损害。 需要特殊实验室和特殊设备。 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法),2022/11/29,70,荧光染色法 乙酰乙酸荧光素法 当细胞受到损伤时,细胞膜的选择通透性 屏障作用消失,利用乙酰乙酸荧光素和溴化 乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在 荧光显微镜下迅速区分受损细胞。,2022/11/29,71,发光细胞活力测试 采用一种独特的、稳定性荧光素酶来检测有活力 细胞。荧光素酶利用荧光素、氧和ATP作为反应底 物，产生氧化荧光 素，并以光的形式释放能量。由 于荧光素酶反应需要ATP，因而反应产生光的总量 和反映有活力细胞数的ATP总量呈正比。产
29、生的发 光信号和培养基中的有活力细胞数呈正比。 特点 适用于高通量应用，测试大批量样品可快速得到 结果。需要特殊的发光仪或CCD相机读取发光信号。,2022/11/29,72,流式细胞光度术(FCM 法) 利用鞘流原理,使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单 列,按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光,检测 器可逐个对细胞的荧光强度进行测定。 特点 对细胞测定能力为30-60万个细胞/分钟,同时可对细 胞的核酸,蛋白质酶、细胞周期分布等八种参数进行 测定。,2022/11/29,73,在药物开发中的应用,药物筛选模型 整体动物水平 组织器官水平 细胞分子水平细胞分子水平药物筛选模型 细胞系的生物学
30、特征较为一致，用于观察药物对细胞形态及生理特征的影响，判断药物疗效及其毒性。 材料用量少，药物作用机制较明确，实现大规模筛选，缩短新药筛选周期。,2022/11/29,74,模型优势 大样本量的筛选(扩大筛选对象和范围)。 一药多筛(样品量少，珍贵药物多模型筛选， 扩大新药范围)。 高通量药物筛选(HTS) 计算机控制的自动化大规模筛选体系。利用细胞培养制出的新药 基因工程药物 细胞工程药物,2022/11/29,75,细胞培养中的药物试验问题 细胞的选择 敏感株 原代 细胞 性别系(株) 药物的溶解和保存 溶剂的选择 药物剂量 半效剂量(ID50) 选择合适指标粗略估算法 借用药物LD50精确计算 药物作用时间 接种后约第48小时(指数生长期) 时-效曲线,2022/11/29,76,思考题 1. 应用细胞培养技术进行实验研究中细胞 生长、活力及细胞毒的测定方法 2. 角质形成细胞体外生长特点,2022/11/29,77,谢 谢！,78,谢谢！,79,
