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1、.,表面增强拉曼光谱分析原理及应用,.,一、引言二、拉曼光谱基本理论三、拉曼光谱仪器介绍四、表面增强拉曼光谱概述五、表面增强拉曼光谱的应用六、前景展望,.,一、引言,用单色光照射透明介质（气体、液体或固体）时，绝大部分的光沿着入射光的方向透过，在透射和反射方向以外会出现光的散射现象。 当激发光的光子与作为散射中心的光子相互作用时，大部分光子只是改变方向发生散射，而光的频率与激发光的频率相同，这种散射称为Rayleigh散射。 约占光散射强度的10-610-9的散射，不仅改变光的传播方向，而且散射光的频率不同于激发光的频率，这种散射称为Raman散射。,.,光散射的过程：激光入射到样品，产生散射
2、光。,散射光,弹性散射（频率不改变-瑞利散射）,非弹性散射（频率改变-拉曼散射）,.,.,2、拉曼光谱基本理论,2.1 拉曼光谱历史渊源 1923年德国的Smeka理论上预言了光的非弹性散射 。 1926年印度物理学家Raman在论文中开始并没有肯定这种散射是非弹性的,以后的许多次实验最终证明了这种散射的非弹性,他将这种效应称为“一种新辐射”。 1928年,Raman和Kishnan首先在液体苯中观察到了这种散射效应。此后不久,俄国物理学家Lardsberg和MandelStam在石英中也发现了同样的光散射现象,他们称之为“联合散射光谱”。,.,1928年，Cabanues和Rocard在巴黎
3、也证实了Raman的观察结果,Pringsheim撰文总结并指出Raman发现的是一种全新的现象,并建议称之为Raman效应, 1930年42岁的Raman为此获得了诺贝尔物理学奖,这是亚洲人获得的第一个诺贝尔科学奖。,.,2.2拉曼光谱基本原理,拉曼光谱是单色光束入射光的光子与分子发生非弹性散射的结果。在非弹性碰撞过程中，光子与分子之间发生能量交换，光子不仅改变运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子，或分子的振动和转动能量传递给光子，从而改变了光子的频率，这种散射过程称为拉曼散射。,.,2.3拉曼光谱量子理论,瑞利散射：弹性碰撞，无能量交换，仅改变方向。拉曼散射：非弹性碰撞；方向改变，且有
4、能量交换。,.,拉曼散射的两种能量差,.,A、E=h(v0 v）产生stokes线：强；基态分子多B、E=h(v0 v)产生反stokes线：弱 Stokes与反Stokes线的频率与入射光频率之差v称为Raman位移。同一种物质分子，随着入射光频率的改变，Raman线的频率也改变，但位移v始终保持不变，故Raman位移与入射光频率无关。,.,Rayleigh,Stokes,Anti-Stokes,ResonanceRaman,Fluorescence,.,拉曼光谱研究分子振动和转动模式的机理与红外光谱的异同点？,相同点：同属于分子光谱。两者都是研究分子振动的重要手段。,不同点：一些同核原子对
5、称结构的官能团(如：- C=C-、-N=N-、-S-S-等)在红外光谱仪较难检测的信息，在拉曼光谱仪上却有较强的反映；而在红外光谱中有很强吸收峰的不均衡对称的官能团，在拉曼光谱却表现很弱。,.,3、拉曼光谱仪器,激光Raman光谱仪激光光源：A、He-Ne激光器，波长632.8nmB、Ar激光器波长514.5nm 488.0nm,.,傅里叶变换-Raman光谱仪光源：Nd-YAG钇铝石榴石激光器（=1064nm）,.,3.1 仪器结构,1、激光光源 根据所用的材料不同大致可把激光器分为气体激光器、固体激光器、半导体激光器和燃料激光器等四大类。气体激光器的类型最多，在拉曼光谱仪中的应用也最广泛。
6、它包括原子气体激光器、离子气体激光器、分子气体激光器以及准分子激光器。固体激光器主要有红宝石激光器、掺钕的钇铝石榴石（YAG）激光器、掺钕的玻璃激光器等。这类激光器的特点是输出功率高，并且体积小又很坚固。其YAG激光器是一种比较有用的固体激光器，其激光波长为1064nm。半导体激光器在所有的激光器中是效率最高、体积最小的一种激光器。,.,2、外光路系统 外光路系统一般是指在激光器之后、单色器之前的光学系统，它的作用是为了有效地收集拉曼散射光。在外光路系统中，激光器输出的激光首先经过光栅，以消除激光中可能混有的其它波长的激光以及气体放电的谱线（若激光无杂线时，可不用此光栅）。纯化后的激光经棱镜折
7、光改变光路再由透镜准确地聚焦在样品上。样品所发出的拉曼散射光再经聚光透镜准确地聚集在单色仪的入射狭缝上。,.,3、样品池 由于在可见光区域内，拉曼散射不会被玻璃吸收，因此拉曼光谱的一大优点是样品可放在玻璃制成的各种样品池中，这给样品的拉曼测试带来很大便利。样品池可以根据实验要求和样品的形状和数量而设计成不同的形状。,.,4、单色器 经样品散射的光，其绝大部分为Rayleigh散射光，Raman散射光强度仅为Rayleigh散射光强度的10-610-9，散射光由外光路系统收集进入单色仪。单色仪是色散型拉曼光谱仪的心脏部分，它应具有杂散光少、色散度高等特点。为了降低Rayleigh散射光对检测强度
8、较弱的拉曼散射光的影响，通常采用双单色仪，有时甚至采用三单色仪来进一步降低杂散光，提高分辨率。但光栅的反射率一般小100%，使用多光栅必然要降低光通。,.,5、检测和记录系统 激光拉曼光谱仪中一般采用光电倍增管做探测器，由于拉曼散射强度很弱，这就要求光电倍增管要有高的量子效率和尽可能低的热离子暗电流。近年来，液氮冷却的CCD型电子偶合器件探测器的使用可大大提高探测器的灵敏度。由探测器输出的信号必须经放大，然后由记录仪记录或输出到计算机上。,.,3.2拉曼光谱技术优越性,1、水的拉曼散射强度很微弱,因此拉曼光谱是研究水 溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。2、拉曼一次可以同时覆盖很广波数的区
9、间,可对有机物及无机物等多种物质进行分析。相反,若让红外光谱覆盖如此广阔的区域则必须改变各种器件的参数,相比较而言程序复杂不具有通用性。 3、拉曼光谱的谱峰清晰尖锐,适合定量研究以及运用差异分析进行定性研究。在化学结构分析中,独立的拉曼区间的强度和功能集团的数量相关。,.,4、由于激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。而且,拉曼显微镜物镜可以将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小体积的样品。 5、利用共振拉曼效应,可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动,这些发色基团的拉曼光强能被选择性地增强1000到10000
10、倍。,.,4、表面增强拉曼光谱概述,4.1 SERS的发现 表面增强拉曼散射现象第一次被观测到,是在1979年,Fleischman小组在对粗糙化的Ag电极表面的吡啶进行研究时,发现其具有巨大的拉曼散射现象4。后来直到VanDuyne和Creighion领导的两个研究小组5,6分别重复了这个实验并证实了这一现象。通过计算,这种银电极表面的吡啶分子的拉曼信号是其水溶液的106倍。这一崭新的现象被称之为表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)。,.,4.2 SERS基本原理,SERS效应可以使拉曼信号得到高达几个数量级的增强,通常是增强来自分
11、子的信号。SERS中信号的增强主要来自于光与金属之间的电磁作用。这种作用会通过等离子体共振激发使得激光场得到极大的增强。要产生这一现象,分子必须吸附在或者非常接近金属表面(通常最大约为10nm)。SERS的命名,能很好的总结这一效应的要点:,.,Surface(S): SERS是一种表面光谱技术,因此分子必须吸附在(或者很接近)金属表面。这是对SERS的应用来说最主要的一点。必须确保要检测的分子“贴” 到了金属基底的表面。Enhanced(E): 信号高达104-107的增强是由金属基底上的等离子体共振造成的。事实上,等离子体共振是与金属的电磁辐射作用有关的一系列效应的简称。另外，SERS效应
12、中,金属以纳米结构的形式出现,从金属溶胶到用纳米光刻制或者自组装制备,形式变化多样。不同的金属,要求的粗糙度也不一样。在可见光范围内，Ag的粗糙度在100nm左右,有较好的增强效果8。而Cu的粗糙度在50nm，在红外区增强最明显9。,.,Raman(R): 这项技术存在于分子(SERS探针或被分析物)信号的测量。拉曼光谱研究的是非弹性散射,能解析被探测分子的化学结构尤其是振动结构。S: 表示scattering或者spectroscopy，当强调光学效应时,用scattering；当强调光谱技术及其应用时,用spectroscopy。,.,4.3 SERS机理,为了解释 SERS 的增强机制，
13、人们提出了不同的理论模型。由于分子的拉曼散射是分子在外电场作用下被极化而产生极化率，交变的极化率在再发射的过程中，受到分子中原子间振动的影响，从而产生拉曼散射光。散射光的增强可能是由于作用在分子上的局域电场的增加和分子极化率的改变，可以形象地把分子的极化偶极矩看成是电磁效应和分子效应的乘积。目前学术界普遍认同的 SERS 机理主要有物理增强机理和化学增强机理两类, 物理增强机制通过局域场和偶极发射起作用，化学增强机制通过分子的极化率起作用。,.,4.3.1物理增加机理,物理类模型致力于阐释金属表面局域电场的增强，它认为，具有一定表面粗糙度的类自由电子金属基底的存在，使得入射光在表面产生的电磁场
14、得到较大的增强，而拉曼散射强度与分子诱导偶极矩 P 的平方成正比，因此极大地增加了吸附在表面的分子产生拉曼散射的几率，从而提高了检测到的表面拉曼强度。物理类模型主要包括以下几种典型模型。,.,A、表面电磁场模型 表面电磁增强模型又可称为表面等离子体共振模型。该模型认为，在光电场作用下，金属表面附近的电子会产生疏密振动。因此当粗糙化的衬底材料表面受到光照射时，衬底材料表面的等离子体能被激发到高的能级，而与光波的电场耦合，并发生共振，使金属表面的电场增强，从而产生增强的拉曼散射。,.,B、天线共振子模型 天线共振子模型是 P.Watcher 教授10在1983年提出的 SERS 增强机制理论模型。
15、该模型认为具有一定粗糙度的金属表面的颗粒或凸起可看作是有一定形状，能与光波耦合的天线振子。粗糙金属表面的突出物或各种微粒可以被看作位于电磁场中的天线振子，它们既可以吸收电磁波，也可以发射电磁波。当电磁波波长和粒子尺寸之间满足一定条件时，电磁波在粒子中将发生共振，此时辐射场最大；同时，吸附在粒子表面上分子的拉曼散射光(也是一种电磁辐射)强度也会受到天线振子的增强，从而产生 SERS 效应11。,.,C、表面镜像场模型 表面镜象场模型是提出得比较早的电磁增强类模型之一，镜像场模型假定金属表面是一面理想的镜子，吸附分子为振动偶极子，它在金属内产生共轭的电偶极子，以此在表面形成镜像光电场。入射光与镜像
16、光电场都对吸附分子的表面拉曼信号起增强作用，再加上表面反射造成两倍的局域电场增强，可以得到总增强效应。,.,D、避雷针效应 金属粗糙过程中产生的表面粒子形状各不相同，一些粒子或粒子的某些部位曲率半径非常小，这些颗粒的尖端处具有很强的局部表面电磁场。曲率半径越小，其表面电场强度越大，从而引起拉曼散射强度的增强。,.,4.3.2 化学增强机理,A、电荷转移模型 电荷转移模型认为13：在适当波长的激光照射下，金属中的电子被激发到电荷转移态上去，这会引起分子原子核的骨架松弛，因为分子在基态和激发态下的平衡位置不同。当电子再回到金属中时发射的光子能量就比入射光少了一个振动量子的能量。增强的原因是散射过程
17、同电荷转移态共振。,.,B、活位模型 活位模型认为：在所有吸附在金属颗粒表面的分子中，只有当其吸附在金属颗粒表面某种特殊的位置(活位)的才能产生强的表面增强拉曼信号。 总的来说，物理类模型所涉及的分子与金属间作用为物理吸附，具有长程效应，它的代表为 EM 模型。化学类模型强调吸附分子与金属基底间的吸附，具有短程效应，它的代表为 CT 模型。,.,5、SERS应用,5.1 SERS检测微量添加物的研究 5.1.1 中成药中微量西药成分的研究 中药的荧光现象很强，而荧光是拉曼散射的“硬伤”，特别是在成分复杂的中药中，西药的光谱信号常常被强荧光遮盖，常常表现为以上图谱 。,.,SERS可以大大降低荧
18、光的干扰，同时将信号放大10的n次方倍。以往关于SERS的研究，大都限于研究纯化合物。因为SERS的高灵敏度SERS 常常作为一种检测器同其它经典方法联用来检测混合物中的各成分或某些成分，常见的联用方法有TLC-SERS、HPLC-SERS和CE-SERS等。在混合物的SERS研究方面，一般是研究同类化合物的共存情况，且各化合物在浓度数量级上相差不远。,.,张雁15等人对表面增强拉曼光谱检测中成药中的西药成分进行了研究。马来酸罗格列酮和盐酸苯乙双胍都是常用的降糖类化学药，也是药品市场上常见的非法添加化学药品种。这两种化学药的特点是每日服用量低，即非法添加比低，用传统HPLC方法检测消耗时间长。
19、我们用SERS对它们的光谱进行了考察，检测速度快，结果准确，且不需对中成药样品进行任何分离提取，操作简便快捷。,.,马来酸罗格列酮标准品溶液的 SERS 谱图（C=0.0003% ）,.,添加了不同比例的马来酸罗格列酮的中成药水溶液的SERS 谱图（马来酸罗格列酮添加于中成药中的比例：a:1%,b:0.8%,c:0.5%,d:0.3%,e:0.1%，f:0% 。,.,盐酸苯乙双胍标准品溶液的 SERS 谱图（C=0.0003% ）,.,添加了微量盐酸苯乙双胍的中成药水溶液的 SERS 谱图（盐酸苯乙双胍添加于中成药中的比例：a:1%,b:0.8%,c:0.5%,d:0.3%,e:0.1%。）,
20、.,盐酸苯乙双胍与马来酸罗格列酮标准品混合溶液的SERS 谱（C=0.0003%）,.,两种西药添加于中成药中的比例：a:马来酸罗格列酮0.5%，盐酸苯乙双胍 0.8%；b:马来酸罗格列酮 0.3%，盐酸苯乙双胍 0.5%；c:马来酸罗格列酮 0.1%，盐酸苯乙双胍0.3%。,.,5.1.2 苏丹红的表面增强拉曼光谱 苏丹红原料的 SERS 图谱(C=0.0001%),.,添加了 0.05%苏丹红的番茄酱的 SERS,.,实验初步说明，SERS用于检测复杂混合体系中的微量特定成分有其独特的优势。实验不需要对复杂样品进行任何的前处理及提取分离，可以对其中的微量特定成分进行直接检测，且检测灵敏度高
21、。整个实验过程不需要使用有机试剂，经济、快捷、环保。,.,5.2 快速检测牛奶中的三聚氰胺 目前，检测三聚氰胺的国家标准检测方法为高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法三种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为 2 mg/kg、0.05 mg/kg 和 0.01mg/kg16。但对牛奶收购、运输环节的三聚氰胺现场快速测定需求，上述技术存在成本高、检测周期长等缺陷。现场快速测定三聚氰胺的技术成为食品安全监管部门和生产企业的需求。 赵宇翔17等人采用便携式拉曼检测仪，结合表面增强试剂技术，牛奶中三聚氰胺检测限可达 2.0 mg/L，且重现性良好，样品前处理简单，检测时间短，
22、检测成本低，设备操作相对简捷，适用于食品安全监管部门和食品生产企业。,.,5.2.1 三聚氰胺的表面增强特征光谱图 含 5mg/L 三聚氰胺的牛奶样品的表面增强拉曼光谱,.,5.2.2 灵敏度试验三聚氰胺梯度浓度对比试验,.,5.2.3 干扰物质和梯度浓度三聚氰胺混合牛奶标准溶液的检测 10g/L含氮化合物和梯度浓度三聚氰胺混合牛奶标准溶液的检测结果见下表，由实验结果可见，三个分析人员的实验测量结果对 2.0 mg/L 及以上浓度的样品阳性率达 100 %。,.,表面增强拉曼光谱快速测定牛奶中的三聚氰胺方法的检测限为 2.0 mg/L；常见的牛奶中的尿素、亚硝酸钠等共存物均不干扰检测，特异性较
23、好。该方法操作简单，易于掌握，同时可在很短的时间内进行检测。整个操作流程从样品制备、检测、到结果显示一般可在 10 min 内完成，因此尤其适宜于现场筛检。方法也可适用于食品安全监管部门和食品生产企业现场的三聚氰胺快速测定。,.,5.3 SERS快速检测水产品中孔雀石绿 孔雀石绿是一种人工合成的三苯甲烷类碱性染料,自20世纪30年代起就被广泛用于渔业生产,防治水霉病。研究发现孔雀石绿易为鱼类吸收并代谢为无色孔雀石绿,且孔雀石绿及其代谢产物均有毒性和致癌性。目前检测孔雀石绿的方法很多,国家标准检测方法为高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法,检测定量限分别为2.0g/kg、0.5g/kg。 顾振华
24、18等人采用便携式拉曼检测仪,结合表面增强试剂技术,水产品水样中孔雀石绿检测限可达5.0g/L,且重现性良好,样品前处理简单,检测时间短,检测成本低,设备操作相对简捷,适用于食品安全监管部门和食品生产企业。,.,5.3.1 孔雀石绿的表面特征拉曼光谱图 用表面增强特征拉曼光谱技术对10g/L孔雀石绿水溶液进行测定,表面增强拉曼光谱显示432437 cm-1,11661170 cm-1,16131617 cm-1处有孔雀石绿的特征峰,可做孔雀石绿定性检测的依据。如432437 cm-1,11661170 cm-1,16131617 cm-1,同时出现波峰,且强度大于1000,则证明样品中含有孔雀
25、石绿。,.,含10g/L孔雀石绿水溶液的表面增强拉曼光谱,.,5.3.2 灵敏度试验孔雀石绿梯度深度对比实验,1.0,2.0,5.0,10.0,(n=0),(n=0),(n=15),(n=15),.,5.3.3干扰物质和梯度浓度孔雀石绿混合标准溶液的检测,（n=0),(n=15),（n=0),（n=0),（n=0),（n=0),（n=0),(n=15),(n=15),(n=15),(n=15),(n=15),.,5.3.4 水产品水样的检测孔雀石绿现场样品检测的结果比较 由表可见,对水产品养殖水中孔雀石绿总含量大于5.0g/L的水样检测结果均为阳性,阳性符合率达100%；对水产品未检出(检出限
26、0.5g/L)孔雀石绿的水样检测结果均为阴性,阴性符合率达100 %。,.,表面增强拉曼光谱快速测定养殖水中的孔雀石绿方法的检测限为5.0g/L常见的水体中的尿素、亚硝酸钠以及海水晶等共存物均不干扰检测,特异性较好。该方法操作简单,易于掌握,同时可在很短的时间内进行检测。整个操作流程从样品制备、检测到结果显示一般可在3 min内完成,因此尤其适宜于现场筛检。方法也可适用于食品安全监管部门和食品生产企业现场的孔雀石绿快速测定。,.,4M.Fleischmann,P.J.Hendere,and A.J.Mcquillan,Chem PhysLett.26(1974)1235 AlbrechtM.G
27、.,CreightonJ.A.,J.Am.Chem.Soe.99(1977)52156 JeanxnaireD.L.,VanDuyneR.P.,J.Eleetroanal.Chem.84(1977)10 Mo Y,Mrke I,Wachter P.Surface enhanced Raman scattering of pyridine on silver surfaces of different roughnessJ.Surface Science.1983,133,(1):L452-L458.11 李佳伟,白莹,莫育俊.天线共振子理论对吡啶分子在铁钴镍衬底上 SERS 增强因子的计算J.
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