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1、【实验四】生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定,1,1实验目的,1 学会本实验的准备2 练习并熟练掌握鉴定生物组织中可溶性糖、脂肪、蛋白质的基本方法。3 学会教学生进行实验探究。4弄清实验过程中应注意事项，易出现的问题及解决方法。,2,实验原理：,某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应如：糖中的还原糖与斐林试剂发生作用可以生成砖红色沉淀；蛋白质与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应；脂肪可以被苏丹染液染成橘黄色。因此，可以根据与某些化学试剂所产生的颜色反应来鉴定生物组织中糖、蛋白质和脂肪的存在,3,还原糖的鉴定原理 生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦
2、芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基），因此叫做还原糖。蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟基，因此叫做非还原性糖，不具有还原性。本实验中，用斐林试剂只能检验生物组织中还原糖存在与否，而不能鉴定非还原性糖。斐林试剂由质量浓度为0.1 gmL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05gmL的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的Cu2O沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。其反应式如下：CH2OH(CHOH)4CHO2Cu(OH)2CH2OH(CHOH)4COOHCu2O2H2O用斐林试剂鉴定还原糖时，溶
3、液的颜色变化过程为：浅蓝色棕色砖红色(沉淀)。鉴定可溶性还原性糖的另一种方法：多伦试剂法。多伦试剂即硝酸银氨水溶液，配制方法：取0.3ml2硝酸银溶液，滴入10氢氧化钠溶液，再滴入2氨水溶液，边滴边摇动试管，直到生成的沉淀恰好溶解，即得到澄清的硝酸银氨水溶液。现用现配。,4,蛋白质的鉴定原理 鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲试剂。双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1 gmL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.01 gmL的硫酸铜溶液。在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子
4、中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此，蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。,5,供选材料：,l 可溶性还原性糖的鉴定：苹果含果糖较高，实验效果也很明显，且容易在市场上买到。但要注意，苹果组织液必须临时制备，切勿保存时间过长。因为苹果多酚氧化酶含量较高，组织液很容易被氧化成褐色，将反应产生的颜色覆盖。温度高时，氧化的速度更快。而梨和白心萝卜的组织液不会有这种现象出现。l 蛋白质的鉴定：鸡蛋清：蒸馏水=1:9混合均匀，再用4层纱布过虑，放入滴瓶中备用，这样配制的蛋清溶液与双缩脲试剂反应后不会粘固在试管内壁上，反应也彻底，试管也容易洗刷干净。也可以用浓豆浆代替蛋清溶液,6,器材,显微镜、双面刀片、试
5、管、试管夹、大烧杯、酒精灯、三脚架、石棉网、试管架、载玻片、吸水纸、电炉。,7,试剂配制：,斐林试剂甲液 氢氧化钠的质量浓度0.1g/ml的溶液乙液 硫酸铜的质量浓度0.05g/ml的溶液使用时临时配制，将4滴5滴乙液滴入2ml甲液中，配完立即使用。与斐林试剂原理一样的本尼迪试剂配制后可长久保存，配方如下：无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中冷却后加至150ml。取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml。再将冷却的150ml硫酸铜溶液倾入即可。苏丹III溶液的配制称取0.1g苏丹III或IV干粉，溶于50ml丙酮中，再加入70酒精50ml即可使
6、用。苏丹溶液的配制 称取0.1 g苏丹干粉，溶于50 mL丙酮中，再加入体积分数为70%的酒精50 mL，充分混合后即可使用。双缩脲试剂的配制：取10g氢氧化钠放入量筒中，加水至100ml，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成氢氧化钠的质量浓度为0.1g/ml的溶液，瓶口上塞上胶塞，贴上标签：试剂A取1g硫酸铜放入量筒中，加水至100ml，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成硫酸铜的质量浓度为0.01g/ml的溶液（蓝色），瓶口上塞上胶塞，贴上标签：试剂B,8,方法及步骤：,一、还原糖的鉴定 1.制备生物组织样液 （1）将洗净苹果切成小块。（2）取几小块（5g）放入研钵中，加少许石英砂研磨，再加5ml水，
7、继续研磨。（3）将玻璃漏斗插入试管中，在漏斗上垫一层纱布，将研磨液过滤。 2.实验操作方法和观察,9,（1）取一支试管，向试管内注入2ml苹果组织液（2）向试管内注入2ml刚配制的斐林试剂。振荡试管，使溶液混合均匀，此时溶液呈蓝色。（3）将这支试管放进盛有开水的大烧杯中，用酒精灯加热煮沸2分钟左右。在对试管加热煮沸的过程中，随时仔细观察试管中溶液的颜色发生了什么变化。,10,二、蛋白质的鉴定,1. 制备蛋白质稀释液（实验教师准备） 2. 实验操作方法和观察（1）取二支试管，向一只试管内注入2ml蛋白质稀释液。（2）向试管内加入2ml双缩脲试剂A（质量浓度为0.1g/ml的NaOH溶液），摇荡均
8、匀。注意观察试管内溶液的颜色有什么变化。（3）再向试管内加入3-4滴双缩脲试剂B（质量浓度为0.01g/ml的硫酸铜溶液），摇荡均匀。注意观察试管内溶液的颜色有什么变化。3、 结论：蛋清组织液与双缩脲试剂发生作用后，产生了（ ）色反应，这说明蛋清组织液中含有（ ） 4、 另一支试管内装入蛋清组织液的作用是（ ）,11,三、脂肪的鉴定：,1、 取一粒浸泡34小时的花生种子，去皮后纵切下一些薄片（注意刀片不要划伤手指）2、 用毛笔将最薄的一片移到洁净的载玻片的正中央3、 向花生薄片上滴23滴苏丹染液，染色23分钟后用吸水纸吸去薄片周围的染液（染色的时间一定把握好）4、 在薄片上滴12滴50%的酒精
9、以洗去浮色，用吸水纸吸去周围的酒精5、 在薄片上滴12滴蒸馏水，盖上盖玻片（盖玻片不要平放，应倾斜一定的角度下放，以免产生气泡，若有气泡，可在一边滴蒸馏水另一边用吸水纸吸水至无气泡止）6、 用低倍镜寻找装片的最薄处（12层）并将这部分移到视野的正中央，观察已着色的圆形小颗粒。7、 换用高倍镜观察（注意：在使用显微镜的过程中显微镜一定要平放不可倾斜） 8、 结论：苏丹染液与花生子叶细胞内圆形小颗发生了（ ）色反应，这说明花生种子内含有（,12,鉴定脂肪的实验中，用刀片将花生子叶削下很薄的一片，放在载玻片上然后滴加12滴5乙醇，乙醇是脂溶性溶剂。可将花生细胞中的脂肪颗粒溶解成油滴，浸5分钟后，用吸
10、水纸将切片周围乙醇吸去，然后滴加0.2苏丹III染液（比0.1浓度的效果更佳）。由于油滴加大了折光率，与染液作用后就形成红色透亮的油滴，效果很好。但是不易久放。,13,检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质的实验的改进,一、原实验的不足但原实验不但需要苹果、花生和鸡蛋三种比较难加工的实验材料，且实验内容多，时间长，容易导致学生做实验很匆忙或者实验效果不理想，从而打击学生的信心。并让学生没有时间去考虑实验是为了什么，从实际上剥夺了学生的质疑权力，违背了我们设定实验的初衷。具体不足如下：1、需要水浴加热2分钟。如果教师不提前准备好热水加温过程更长。2、没有对照实验，没有对照怎么能证明水浴加热后的砖红色
11、沉淀就是还原糖还原而成，为什么不可能是Cu(OH)2自身分解产生的呢？ 3、脂肪鉴定实验中，显微镜的操作、子叶切片都需要很长时间。特别是对于才进高中的学生而言，要求所有的学生都能熟练运用徒手切片技术也不现实。4、在学生对生物染色剂的染色特性了解不深的情况下，很难指出显微镜下哪些黄色或红色的东西就是脂肪。,14,二、实验的改进之处由于原实验存在以上不足，我首先选用生活中常见且操作起来很方便的液态状的牛奶，来替换书上的苹果、花生和鸡蛋三类实验材料，大大节省了实验的时间与消耗，体现实验的科学性与实用性，除此之外还对实验进行了以下改进：1、减少实验器材的使用，从而简化实验过程。如：不使用水浴加热、不使
12、用显微镜等。2、改进实验方法，节省时间与试剂。如：糖的鉴定中，使用两只试管同时直接加热法，实验只需几滴斐林试剂，且反应也只有约30秒，这样既节省了时间与试剂，而且起到了很明显的对照作用。3、改验证实验为探究实验。如：给予食用油与水，用苏丹染色观察现象。,15,探究实验的具体过程如下：,31、 给予实验任务 现有一瓶“牛奶”，请学生用实验来探究牛奶中是否含有说明书中所说的糖、蛋白质、脂肪三类成份。 32还原性糖实验 321实验原理：牛奶中的乳糖是一种醛糖（由葡萄糖+半乳糖构成），能还原斐林试剂（0.1% NaOH,5% CuSO4）中的Cu2+产生砖红色Cu20沉淀。,16,322实验过程,取2
13、块试管，编号水、牛奶；滴加4滴斐林试剂A液，再滴加4滴斐林试剂B液，摇匀；再分滴加7滴水、牛奶摇匀；同时用两个试管夹夹着在酒精灯上均匀加热30秒；观察并记录现象（牛奶显现砖红色）。,17,33蛋白质实验,331实验原理：牛奶中富含酶、磷蛋白等蛋白质，其中肽链中的-CO-NH-能在NaOH溶液中与CuS04稀溶液（1%）产生紫色，因而证明蛋白质存在。 332实验过程取2支试管，编号。分别注入约1/8试管水、牛奶；再分别注入1/8试管双缩脲试剂A，摇匀；再分别向试管中加入34滴双缩脲试剂B液，摇匀；观察并记录现象。（牛奶显现紫色）,18,35脂肪实验 341实验原理：牛奶中的奶油和维生素D等是含量
14、丰富的脂类物质，它们可被苏丹染液染成橘红色颗粒。,19,20,342实验过程取过滤纸一片，等距编号：水、食用油、牛奶；分别滴加2滴水、食用油、牛奶于相应处；分别滴加1滴苏丹于3处，染色3分钟；观察并记录现象（水显红色；食用油、牛奶显橘黄色）。结论：奶粉中确实存在还原糖、蛋白质、脂肪。,21,改进后由于实验时间充足，可以继续拓展实验,比如讲解婴儿长期食用劣质奶粉因营养不良造成水肿而出现大头症状，再展示安徽阜阳劣质奶粉导致的大头娃娃事件，然后让学生从劣质奶粉的组成上探究劣质奶粉到底是缺什么造成大头娃娃的想象。还可以让学生自己探究生活中感兴趣想探究的材料。,22,经过以上改进实验，不仅使学生学习了实验的原理与方法，更重要的是打破了学生认识过程中的思维定势，培养了学生的探究能力。同时，也实践了教师不是教科书的执行者，而是教学方案的开发者与学生求知的引导者的新课程理念。,23,结论1将观察到的现象和得出的结论用表格填写。2. 鉴定生物组织中含有糖、脂肪或蛋白质的根据是什么？.3 什么样的糖属于还原性糖？举例说明。我们平时的主食如馒头、米饭中含有大量淀粉，淀粉是还原性糖吗？为什么？你怎样用实验证明的？对淀粉进行怎样的处理就能发生斐林反应或银镜反应？4 要在这个实验中取得明显的实验现象，应该选择什么样的实验材料？请分类举例说明。,24,
