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1、酶免疫技术,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,标记免疫技术,酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术化学发光技术金免疫技术生物素-亲和素免疫放大技术 ,酶免疫技术,基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。,基本特点： 标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 酶促反应专一性，保证特异性。 底物反应放大作用，提高敏感性。 酶标试剂保存稳定。 操作简便，安全易行。,酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 （ELISA） 液相酶免疫测定,酶的选
2、择要求：活性高专一性好易与抗原、抗体偶联底物易得、易保存无毒害产物易测量酶与底物成本价廉,优点(与其他酶比较)分子量较小标记方法简单较稳定溶解性好价格较低底物种类多,HRP催化反应：DH2+H2O2 D+2H2O过氧化物(受氢体）：H2O2 供氢体：OPD、TMB,常用的酶及底物-辣根过氧化物酶(HRP),主酶是糖蛋白(275nm)，无活性，辅基亚铁血红素(403nm)，有活性纯度(RZ)=403nm/275nm 3.0酶活性单位：1min将1umol底物转化为产物所需的酶量,HRP常用底物,邻苯二胺（OPD）:反应后显橙黄色，酸终止后呈棕黄色,最大吸收峰275nm。灵敏度高，比色方便。但配成
3、应用液后稳定性差,显色过程需避光，且有致变异性.四甲基联苯胺（TMB）:反应后显蓝色，目测鲜明，酸终止后呈黄色，最大吸收峰450nm.稳定性好，显色过程无需避光，无致变异性.,碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯的水解酶，不易透入细胞内，但因其敏感性高，空白值低，也较常用。底物常用的有对-硝基苯磷酸酯(PNP)，产物为黄色的硝基酚，测定波长为405nm。-半乳糖苷酶（ -Gal）：来源于大肠埃希氏菌，不受内源性酶干扰，底物为4-甲基伞形酮-D-半乳糖苷，产物为高强度荧光物4-甲基伞形酮，敏感性较HRP者高30-50倍，测量时需用荧光计。,酶标记物的制备,一般要求技术方法简单、标记效率高、重复性好标
4、记反应易控制，标记后不改变活性酶标记物较稳定，不聚合,改良过碘酸钠标记法只适用于HRP过碘酸钠将HRP分子表面的多糖羟基氧化为醛基，醛基可与抗体蛋白的游离氨基结合形成HRP-CH2-NH-IgG复合物再用硼氢化钠还原（终止反应）优点是产率高,戊二醛交联标记法以双功能交联剂戊二醛(活性醛基)为桥 一步法：简便易行，交联时反应物分子间比例不易控制二步法：酶和抗体分步与戊二醛交联，先用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合，再加入抗体反应。酶标记物质量较均一，标记效率较高,酶联免疫吸附试验 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELI
5、SA),(一)基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原抗体的形成） 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）,（二）ELISA技术类型：,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必
6、要的试剂：固相的抗原或抗体即免疫吸附剂（immunosorbent）酶标记的抗原或抗体称为“结合物”（conjugate）酶作用的底物。,1双抗体夹心法,1.将抗体包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。,4.酶催化底物并显色。,双抗体夹心法测抗原,双抗体夹心法特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇,2间接法,1.将抗原包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。,
7、3.再加入酶标记抗抗体（抗IgG），则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。,4.酶催化底物并显色。,间接法测抗体,间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体(酶标抗人IgG)建立检测相应抗体的方法。易受血清中高浓度非特异性IgG的干扰，待测标本需稀释后测定。,1.将抗原包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。,4.酶催化底物并显色。,固相载体,3.双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。,4.竞争法,竞争法特点：
8、用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可采用竞争法模式,5.捕获法（反向间接法）,主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。,（三）ELISA的试剂准备,ELISA中有三个必要
9、的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液,ELISA的试剂准备A,固相载体 结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。 聚苯乙烯、聚氯乙烯 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。,包被的方式,将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯
10、乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,当抗原表位存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原表位不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可用间接捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，
11、待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。间接包被优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。,包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。,包被用抗体,IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较
12、高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。,包被的条件,H9.6碳酸盐缓冲液 加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后续步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉
13、，可以高浓度使用（5%）。,洗涤液在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。,ELISA的试剂准备B,1.结合物,即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中关键的试剂制备结合物时所用抗体一般为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用F(ab)2进行标记，则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,2.酶,用于标记酶的要求： 酶活性高 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性 酶催化底物后信号
14、易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害、价廉,常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、 -半乳糖苷 酶,酶标记方法 1.交联法 以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法（含两个醛基，可分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合）。2.过碘酸钠法 用过碘酸钠活化酶蛋白分子（可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基）后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合
15、物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。,结合物的保存,酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。,结合物的稀释液,用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作
16、液，使用时不需再行稀释，在4-8保存期可达6个月。,试剂准备 C 酶的底物,酶的底物,1.HRP的底物,邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，应避光，致癌性，应用液稳定性差。,E,四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，加酸后变黄色，成色稳定性好，无需避光，无致癌性，但水溶性差,2） 碱性磷酸酶（AP） 常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。 3）-半乳糖苷 酶 常用底物4-甲基伞酮基-D半乳糖苷（4MUG），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮，敏感性较HRP高30-50倍，但测量时需用荧光计。,酶反应终止液常用的HRP反应终止液为2mol/L硫酸,4 对
17、照设定,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,参考标准品,定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗H
18、Bs也是阴性。,5 标本的采取和保存,体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，可能会增加非特异性显色。,加样:,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,基本操作注意事项,保温,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体
19、的结合只在固相表面上发生。 温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,保温方式：ELISA仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。,洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但
20、却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,（1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。,（2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含
21、疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。,洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。,比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标
22、比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。 结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。,酶标比色仪,酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主
23、要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。 操作时室温宜在15-30，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书,6 结果判断,定性测定,定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释
24、标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。,A.阳性判定值： （cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数(0.05)，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。,B.标本/阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。,间接法和夹心法,竞争法,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。a. 阳性判定值法 阴性判定值=0.4NCX+0.6PCX 阳性 A阳性判定值 阴性 A阳性判定值 b. 抑制率法 抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）100%/阴性对照 阳性 抑制率50% 阴性 50%,定量测定,ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。,
