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1、高效液相色谱分析技术方法开发,上海市食品药品检验所陈桂良,方法开发,方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的pKa或pKb值、溶质分子的极性和大小、紫外可见光谱性质、氧化还原行为、浓度范围、溶解度以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或定量要求。,建立高效液相色谱分析方法的一般步骤,通常在确定被分析的样
2、品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题： 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。,分析物,理化性质混合分析物的主要差异分子结构和特性,方法开发前要确定的基本问题1、分析物的物理、化学性质样品基质-决定前处理方法溶解性-决定正、反相方法酸碱性-确定色谱柱类型、流动相组成pKa-确定流动相的pH值化学结构、特征官能团、Etc.,方法开发前要确定的基本问题2、混合分析物的
3、主要差异疏水性差异-用疏水性选择性强的色谱柱极性差异-用具有极性选择性的色谱柱芳香性差异-用芳香选择性色谱柱混合差异-用多种选择型色谱柱分子量差异-GPC、GFC,方法开发前要确定的基本问题3、分子结构决定选用何种分析方法HPLC-UVHPLC-IRHPLC-MSHPLC-ELSDEtc.,如何得到最理想的分析结果,流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好,但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果,可以改变下列的一项或数项条件: 流动相 固定相 pH 温度,如何选择适当的色谱柱理想的柱子,可以适用于分析所有的化合物,永远不会坏理想分离度,
4、决定峰分离度的三个要素,峰保留时间,选择性(出峰的顺序),柱效,固定相的选择,疏水性的选择,极性的选择,苯基的选择,固定相疏水性考虑的要素,键合相的种类 (C18, C8, Phenyl, etc),表面积,键合相的键合率,色谱柱选择表,颗粒直径及形状(球型及不规则型)柱长及柱内径表面积及孔径碳负荷及键合类型,Luna C18(2),Ginseng RootColumn:Luna 5 m C18 / ODS (2)Dimensions:150 x 4.6 mm IDElution Type:GradientEluent A:Acetonitrile/water (15:85)Eluent B:
5、Acetonitrile/water (80:20)Flow Rate:1.5 mL/minTemperature:25 CDetection:UV-Vis Abs. Variable Wave. 205 nm,App ID 1125,Luna C8(2) & C5,减少疏水性化合物的保留时间减少分析的时间,Synergi Max-RP,疏水性和 C18柱类似 为一支C12柱提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合物,Synergi Max-RP,Basic Drugs at Neutral pH,疏水性的比较,C18 phases,C8 phase,300 C18 phase,极性选择性
6、的考虑,首先考虑 固定相的极性封尾,封端基团 分析物的极性官能基之间的作用,极性选择性,如何增加极性的选择性 极性基团封端 极性基团镶嵌 苯基,极性选择性,Columns: Luna 5m C18(2)YMC-Pack 5m Pro C18Synergi 4m Polar-RP (Ether-linked Phenyl)150 x4.6mmMobile phase:75:25 Methanol:waterFlow rate:1 mL/minComponents:1. Estrone2. Estradiol,极性选择性,Synergi Max-RP - C12Synergi Hydro-RP -
7、 C18Synergi Fusion-RP C18Synergi Polar-RP Phenyl,Synergi,Silica Advantage Balancing Efficiency & Backpressure,Linear Velocity (mm/sec),Plate Height (H),5,4,3,Flow Rate (mL/min),Pressure Drop (Bar),higher efficiencies,lower backpressures,Synergi,Synergi Max-RP,与C18柱性能类似的C12柱,Synergi Polar-RP,保留极性和苯基化
8、合物,100% 水溶液稳定,增加极性的选择性,Synergi Hydro-RP,疏水性非常强,极性封端100%水溶性稳定,增进极性的选择性,Synergi Hydro-RP VS. Luna C18(2),Synergi Hydro-RP,Synergi Hydro-RP,Synergi Max-RP,Mobile Phase:A: 20mM KH2PO4, pH 4.6B: AcetonitrileGradient: A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 minFlow rate: 1.5 mL/minSample:1. Morphine2. Hydromorpho
9、ne3. Codeine4. Nalorphine5. Oxycodone,Synergi Hydro-RP,Synergi Fusion-RP,增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间,在水溶液中100%稳定,Running Conditions,Mobile phase: 75:25 20mM Potassium phosphate pH 2.5: AcetonitrileFlow rate: 1.5 ml/minTemperature: AmbientDetection: 210nmInjection: 1. Maleic acid2. Chlorpheniramine 3. Tripr
10、olidine 4. Diphenhydramine,Synergi Fusion-RP 4 80,一般的 C18柱,极性增大,疏水性减少,苯基的选择性影响,被分析物和固定相之间产生的作用,LunaPhenyl-Hexyl,使用甲醇可以增加作用效果,Luna Phenyl-Hexyl,具有疏水性和苯基双重的选择性,重复性高和稳定的苯基固定相,Luna Phenyl-Hexyl,Green Tea(绿茶)Column: Luna 5u Phenyl-HexylDimensions: 250 x 4.6mmMobile Phase A:0.2% Acetic acid in Water/Aceto
11、nitrile (91:9)B:Water/Acetonitrile (20:80)Gradient: 100%A to t=25min, (68:32) t=25min to t=35min, hold 100%B for 10 min.Flow Rate: 1ml/minTemperature: 350C,App ID 14436,苯基的影响,Columns: Luna 5m C18(2) 150 x4.6mmLuna5m Phenyl-Hexyl 150 x4.6mmSynergi 4mm Polar-RP150 x4.6mmMobile phase:50:50 Acetonitrile
12、:20mM Potassium phosphate pH 2.5Flow rate:1.0 mL/minComponents:Acidic, aromatic compounds 1. Indoprofen2. Ethyl paraben3. Naproxen4. Diflunisal5. Indomethacin6. Ibuprofen,C18(2)Phenyl-HexylPolar-RP,苯基的影响,H的影响,当选择流动相的pH时,我们必需考虑到pH对分析物和柱子两者的影响,H对柱子的影响,即使键合完美,封端完好,硅胶表面还是会存在Si-O-H的微酸游离基 pKa3.5,如果流动相的pH是
13、4以上,此 Si-O-H的游离基会脱氢, 成为带负电的Si-O-(这会造成和分析物之间的极性反应,而造成峰拖尾),如果流动相的pH是8(或10)以上,硅胶会被破坏,造成柱子损害,H对分析物的影响,基本上,反相柱的峰保留时间长短,主要归因于疏水性的非极性反应.所以要增长峰保留时间,必需选择流动相的pH能够让分析物保持中性,对酸性分析物(pKa3-6),基本选择pH在 pKa以下,对碱性分析物(pKa9-11),基本选择pH在 pKa以上,对碱性分析物的分析建议,多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定,所以一般分析碱性化合物时,会选择于pH1.5-3下进行分析.在此pH条件下,硅胶表面的游离Si-O-H
14、会保持中性,减少离子间的二极反应,因而减少峰拖尾,峰型较好,但是在低pH条件下,碱性化合物的极性增加,疏水性减少,如果要增加峰保留时间,流动相的有机溶剂比率必需减少,对碱性分析物的分析建议,在高pH条件下,碱性化合物可以保持中性,疏水性因而增加,但是如果峰保留时间太长,可以将流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间.增加选择分析条件的弹性流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间外,并可以增进峰型(尖),但是问题是:如何在高pH (8以上)条件下分析?,高pH对碱性分析物的分析选择,使用高分子柱,使用双子星柱(GEMINI),Gemini C18 双子星柱,在pH 1-12范围内很稳定；适用于酸
15、,中,碱性化合物,特别是分析中碱性化合物很理想；可以更有弹性的调节pH以得到合适的分析条件。,Gemini C18,流动相pH的影响,pH 1 12 Stability,Gemini C18,pKa,pKa,硅胶纯度（金属含量）Columns: A型硅胶 ( = 旧型号)B型硅胶 (Gemini 5m C18)Mobile phase:10mM 甲酸铵 pH 3.5 : 乙腈: 甲醇（ 35:15:50 ）Flow rate:1.0 mL/minComponents:1.Rhodamine 123 2. Rhodamine 6G3. Rhodamine B Base玫瑰精, 若丹明(一种红色荧
16、光染料),色谱图,A型硅胶C18化合物被吸收B型硅胶 （Gemini C18)峰形、峰高、分离正常,金属的影响（1）,金属的影响（2）,流动相的选择,有机相的选择缓冲液的选择离子对的选择程序洗脱其他,流动相中有机相的选择* 甲醇：洗脱能力较弱，压力较大；使用苯基柱时推荐使用。* 乙腈：洗脱能力较强，压力较小；使用末端吸收时和梯度洗脱时推荐使用。*梯度时：,缓冲液pH值的选择酸性分析物：pHpKa-2单一碱性分析物：pH3.5 或pHpKa+2复杂碱性混合物：pHpKa+2,1.氯磺丙脲（pKa5.0) 2.对羟基苯甲酸丁酯 3.利多卡因（pKa 7.9) 4.苯丙烯啶（pKa6.5) 5.右甲
17、吗南(pKa 9.2),应用实例：苦参色谱柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm流动相：0.01M醋酸铵-乙腈（梯度）,流动相常用溶剂的极性和截止波长 由极性可以看出，在反相色谱中，要使出峰时间加快，可增加流动相中的乙腈比例，但要注意分离度的减小；若要使出峰时间减慢，可增加流动相中水的比例，增加水的比例还会引起分离度的增加；两者之间综合来考虑。举例说明 。异丙醇转相时必须用；四氢呋喃使用时注意波长。必须选用色谱级的。,由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈。 样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒
18、峰。含量测定时，溶剂依情况而定，有时选用流动相费用太高，或是不易于操作。 进样量最好选用定量环的量，以避免由于进样不准而引起的偏差。定量环可进行更换。,各溶剂截止波长,检测器和检测条件的选择,检测器的选择检测条件的选择灵敏度问题,检测器类型 最通用的紫外检测器：注意测定波长较短时，基线有可能会飘；洗柱子时，尽量关闭光源，以延长使用寿命。 二极管阵列检测器：目前使用者越来越多。用于多波长检测、峰纯度测定、对被测定物质进行紫外扫描后选择波长等用途。 荧光检测器：灵敏度更高，对那些g级的制剂品种，有时适用。但缺点是，基线稳定需平衡时间较长。 示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器（电导检测器）等。,举例说明,HPLC法测定盐酸氟西汀的有关物质及其胶囊的含量HPLC法同时测定福辛普利钠片中福辛普利钠及其降解产物福辛普利拉的含量HPLC法用于苯唑西林钠及其制剂中含量和有关物质的测定,
