蛋白质的结构与功能的关系课件.pptx

《蛋白质的结构与功能的关系课件.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的结构与功能的关系课件.pptx（70页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、一、蛋白质结构与功能的关系,蛋白质一级结构与功能的关系 前体与活性蛋白质 分子病,蛋白质空间结构与功能的关系 肌红蛋白的结构与功能 血红蛋白的结构与功能,(一)蛋白质一级结构与功能的关系,1.一级结构是空间构象的基础,在生物体内，蛋白质的多肽链一旦被合成后，即可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中多肽链和侧链R基团形成的次级键来维持的。蛋白质的一级结构决定了它的二级、三级结构，即由一级结构可以自动地发展到二、三级结构。、,二级结构,蛋白质的结构基础,三 级 结 构,四 级 结 构,一级结构是空间构象的基础,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基

2、乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,牛核糖核酸酶,核糖核酸酶A变性，酶的三级结构和活性完全丧失，生成含有8个巯基的多肽链。,加脲和巯基乙醇,去除脲和巯基乙醇，又恢复到天然状态,核糖核酸酶A变性和复性,胰岛素（Insulin）首先合成108个氨基酸的前胰岛素原（pre-proinsulin），随即切去N-端的24个氨基酸信号肽，形成84个氨基酸的胰岛素原（proinsulin），形成正确的二硫键，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸C肽残基被切除，才形成胰岛素。人工合成的胰岛素，A、B链分别合成后，等比例混合后就有活性。,2.前体与活性蛋白质一级结构的关系,胰岛素的体内合成,胰岛

3、素基因,mRNA,核糖体,B chain,A chain,胰岛素原 9kDa,胰岛素 5.5kDa,C 肽,GOLGI,分泌颗粒,血 液,Zn2+MICROCRYSTALS,切割位点,A肽,B肽,30 aa,33 aa,21 aa,前胰岛素原 11.5 kDa,RER,600核苷酸,C肽,24 aa,信号肽,3.蛋白质一级结构的种属差异与分子进化,对于不同种属来源的同种蛋白质进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果，但与功能相关的结构总是有高度的保守性。 以细胞色素C为例：细胞色素C广泛存在于真核生物细胞的线粒体中，是一种含有血红素辅基的单链蛋白质。在生物氧化时，

4、细胞色素C在呼吸链的电子传递系统中起传递电子的作用，使血红素上铁原子的价数发生变化。,细胞色素c的一级结构与生物进化的关系,脊椎动物的细胞色素C由l04个氨基酸残基组成；昆虫有108个氨基酸残基组成；植物则有112个氨基酸残基组成。对不同生物的细胞色素C的一级结构分析表明，大约有28个氨基酸残基是各种生物共有的，表明这些氨基酸残基是规定细胞色素C的生物功能所必需的。其中包括第14和17位上两个半胱氨酸残基是细胞色素C与辅基血红素共价相连的位置；第70-80位上成串的不变氨基酸残基可能是细胞色素C与酶结合的部位。,在分子进化过程中，细胞色素C分子中保持氨基酸残基不变的区域称为保守部位。保守部位的

5、氨基酸都是细胞色素C完成其生物学功能所必需的。,同源蛋白质的物种差异与生物进化,同源蛋白质：在生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。 不变残基 可变残基来自两个物种的同源蛋白质，其序列之间的氨基酸差异数目与这些物种间的系统差异成比例。即在进化位置上相差愈远，其氨基酸序列差别愈大。,4.蛋白质的一级结构与分子病,几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变有关，称之为分子病。在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响，导致疾病的发生。这种变异来源于基因上遗传信息的突变，所以是可遗传的。,与血红蛋白相关的

6、分子病,镰刀状细胞贫血病-血红蛋白或链突变,地中海贫血-血红蛋白或链缺失,被称之为“分子病”的镰刀状细胞贫血仅仅是血红蛋白（Hb）亚基574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即N端的第6位的谷氨酸被缬氨酸取代，发生了变异所造成的。突变导致本是可溶性的血红蛋白聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形而成镰刀状，极易破碎导致贫血。,镰刀状细胞贫血病,血红蛋白分子病,地中海贫血,产生原因： 缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因； 一个或多个基因无义突变缩短的蛋白链；发生移码突变不能合成正确的多肽链； 编码区外突变转录阻断或mRNA不能正确加工。,类型：-地中海贫血-地中海贫血,(二)蛋白质空间结构与功能的关系,

7、蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。 在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应(allostery)。蛋白质(或酶)的别构效应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的调节和某些生理功能的变化都是十分重要的。,1、肌红蛋白Myoglobin（Mb）结构与功能,肌红蛋白：主要肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。肌红蛋白是

8、由一条多肽链和一个辅基血红素（原卟啉IX 和Fe的络合物）组成，除去血红素的脱辅基肌红蛋白称珠蛋白（globin），它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上有明显的同源性，构象和功能也相似，由8个-螺旋组成。,氧气与肌红蛋白的结合,O2与CO竞争结合血红蛋白和肌红蛋白；空气中CO的含量达到0.06-0.08%即有中毒的危险，达到0.1%时则能窒息死亡；O2的结合改变肌红蛋白的构象，但对肌红蛋白的功能影响不大。,构型（configuration）：分L、D型，改变时有共价键的断裂。构象（conformation）：改变无须有共价键的断裂，只是次级键断裂。,2、血红蛋白(hemoglobin,Hb)结构与

9、功能,4个亚基组成，两两相同，每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位。 Hb分子近似球形，4个亚基占据相当于四面体的四个顶角。,辅基血红素（heme）,氧与蛋白不能直接结合；借助过渡金属的低氧态（Fe2）和有机分子原卟啉IX；卟啉化合物着色力强，血红蛋白的铁卟啉使血液呈红色；原卟啉IX和Fe的络合物成为血红素（heme）。,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,卟啉平面,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。血红蛋白存在两种主要构象态：T态（tense sta

10、te）和R态（relaxed state），T态和R态之间能互换，而且均能结合氧，但R态的结合能力要强。作为T态的去氧血红蛋白有专一性的氢键和盐桥起着稳定作用，4个亚基的C末端处于受束缚的状态。血红蛋白除运输氧外，还运输H和CO2。,血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白与血红蛋白结构和功能的比较,结构 共同点 差异： 肌红蛋白只有三级结构，具有一条多肽链，血红蛋白具有四 级结构，含有四个亚基功能共同点：均可与氧可逆结合差异： 肌红蛋白只能贮备氧，而血红蛋白可以运输氧，此外也可运输H+和CO2,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,血红蛋白氧合曲线为 S 形,肌红蛋白氧合曲线为双曲线形

11、,Hb T态和R态互变,Hb氧合与脱氧构象转换示意,Hb与O2的结合或解离曲线呈S型与Hb的变构效应有关。 Hb与O2结合盐键断裂，R型 Hb与O2解离盐键形成，T型 T型对O2亲和力小。 R型对O2亲和力大。,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity)血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应，也即一个O2的结合增加同一Hb分子中其余空的氧结合

12、部位对O2的亲和力。,变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。Hb与O2结合后，Hb的构象发生变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能，Hb称为变构蛋白（allosteric protein）。,(R)relaxed state,(T) tense state,血液中O2的运输 (Hb R/T态的互换),静脉,动脉,环境氧浓度高时Hb 快速吸收氧分子,环境氧浓度低时Hb 迅速释放氧气,释放氧气后Hb 变回 T state,2,3 BPG的作用,2,3 BPG是血红蛋白的别构效应剂，一分子血红蛋白只有一分子2,3 BP

13、G，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。 2,3 BPG将两个链交联在一起，有助于去氧血红蛋白的构象，促进氧的释放。,2,3-二磷酸-D-甘油酸（2,3BPG）是红细胞内血红蛋白的别构效应剂。 2,3BPG 的存在，可使氧与全血中成熟的血红蛋白结合的P50大约提高到26torr。 换言之，红细胞中的2,3BPG实质上是降低了脱氧血红蛋白对氧的亲和性。在红细胞中，2,3BPG与血红蛋白的浓度几乎是等摩尔的。,肺中pO2 （海平面）,肺中pO2 (高原4500米),组织中 pO2,氧饱和度,2,3-二磷酸-D-甘油酸（2,3 BPG）对血红蛋白氧合曲线的影响,当人从海平面上到4500米高原后两天内

14、， 2,3 BPG的浓度有原来的5mM增加到8mM，结果对组织的供氧量又恢复到接近正常水平（0.38）。 如果BPG仍维持5mM水平，对组织的供氧量将减少四分之一，为0.30。,波耳效应 （Bohr effect）pH对氧饱和曲线的影响,氧结合血红蛋白的另外调节作用涉及到二氧化碳和质子，二者都是有氧代谢的产物。CO2能降低血红蛋白对氧的亲和性。在红细胞内碳酸酐酶催化CO2生成一个碳酸（H2CO3），碳酸容易解离形成碳酸氢根离子和一个质子： CO2H2O HHCO3结果使得细胞内的pH降低。低pH 导致血红蛋白中的几个基团的质子化，质子化的基团可以形成有助于脱氧构象稳定的离子对。 CO2浓度增加

15、以及相应的pH降低使得血红蛋白的P50升高，这一现象称之波耳效应（Bohr effect），它提高了氧转运系统的效率。在肺部，CO2水平低，氧很容易被血红蛋白占有，同时释放出质子；而在代谢的组织中，CO2水平相对来说比较高，pH较低，O2容易从氧合血红蛋白中卸载。,3、蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病

16、、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPc-螺旋,PrPsc-折叠,正常,疯牛病,一条肽链对应一个特定的空间结构。 这条法则的破坏是灾难性的。疯牛病的prion就是一个例子。,正常prion,异常prion,蛋白质构象改变与疾病,老年性痴呆（AD,Alzheimeis disease）,老年性痴呆:即阿尔茨海默病，是一种大脑细胞退化萎缩，细胞密度降低的器质性疾

17、病。主要症状：部分或者全部的丧失记忆能力和认识能力。同样是蛋白质构象变化引起的疾病，与淀粉样纤维沉积有关。现在已知，这种纤维的形成是由于一种特征性交联的-Sheet结构的有序排列，且-Sheet结构的每一条链与纤维的长轴垂直。,根据分子外形的对称程度分球状蛋白（globular protein）：亲水基团位于分子表面，疏水基团位于分子内部，形状接近球形或椭球形，易溶于水，如血清球蛋白和肌球蛋白等。纤维状蛋白（fibrous protein）：具有比较简单、有规则的线性结构，呈细棒或纤维状，难溶于水和稀盐溶液，如胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和角蛋白等。根据蛋白质的生物学功能分 酶、运输蛋白质、营养

18、和贮存蛋白质、收缩蛋白质和结构蛋白质等。,第六节 蛋白质的分离与纯化,一、蛋白质分离纯化的一般原则,总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶,二、蛋白质的分离纯化方法,（一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤,利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料,五、蛋白质的分离纯化方法,（一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤,利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素

19、材料,透析,2、密度梯度（区带）离心,6000080000转/分重力60万80万倍,3、凝胶过滤,（二）利用溶解度差别的纯化方法,1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析,3.有机溶剂分级分离法,降低介电常数争夺水化膜,原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同,(三) 利用电荷差别纯化的方法,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,变性,？,迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量

20、,巯基乙醇破坏二硫键,等电聚焦电泳,等电聚焦,双向电泳,双向电泳,离子交换层析,离子交换层析,（四）利用蛋白质选择性吸附的性质,羟磷石灰层析疏水作用层析,（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法,亲和色谱颗粒,具有极强的专一性,六、蛋白质含量测定和纯度鉴定,（一）测定蛋白质总量1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法 4、BCA 法（4,4-二羧-2,2-二喹啉 bicinchoninic acid）5、Bradford法 6、胶体金法7、紫外吸收法,物理性质,化学性质,（二）测定蛋白质混合物中某一特定 蛋白质的含量（三）鉴定蛋白质制品的纯度 1.电泳分析 2.沉淀分析 3.扩

21、散分析,第七节 蛋白质测序,（1）英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。（2）建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（ 20世纪50年代）。（3）Edman降解（20世纪70年代出现）。 仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。 进入20世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。 （4）20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。,蛋白质测序的发展：,（5）对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PV

22、DF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。（6）毛细管电泳技术（20世纪90年代发展起来的微量分析技术）的采用，是蛋白质N端微量顺序测定方法学一个引人注目的发展。其灵敏度比HPLC高两个数量级。可在10fmol的水平检测氨基酸。微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。,（7）蛋白质C端测序：C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。 最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。 直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解

23、试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基的C端顺序测定。,（8） 质谱法用于蛋白质顺序测定： 必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。 20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把FAB得到的分子、离子进行再一次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一组片段的质谱信息，使多肽顺序测定得以实现。, 20世纪80年代末出现了电喷雾质谱和基质辅助激光

24、解吸电离-飞行时间质谱。电喷雾质谱测定分子量数万的蛋白质准确度可达万分之一，主要优点是可与HPLC仪实现液质联用，因而能使一个蛋白质的酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。飞行时间质谱能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质C端与N端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用样品量极微（1-2pmol），且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。,（9）质谱技术不能完全取代Edman降解与其他蛋白质分析方法。通常是联合运用这些技术。（10）蛋白质测序展望： N端测序仪在灵敏度上还需提高。 C端测序技术需要更新型的偶联试剂和更有效的裂解方法。 质谱技术将有令人刮目相看的作为。 一些新的分析技术很可能进入蛋白质序列分析领域，如多维核磁共振方法。,谢 谢 ！,