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1、第六章 分子生物学基本研究法（下）基因功能研究技术,基因表达研究技术基因敲除技术蛋白质及RNA相互作用技术基因芯片及数据分析利用酵母鉴定靶基因功能其他分子生物学技术,6.1 基因表达研究技术,6. 1. 1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。因此，可用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基序列并制成标签。将10-50个序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总标签数的比例即可分析所对
2、应编码基因的表达频率。,常规SAGE方法（short SAGE）基本流程连接子1和连接子2的5端分别加有氨基，以防止5端相连接。,分离提取合成cDNA,用锚定酶AE消化,分3端酶切两份，分别与S类TE标签酶识别位点结合。,标签酶TE酶切,末端补平,连接两份，根据接头1、2设计引物进行PCR,得到双标签，分离纯化串联入载体。,连接10-50个标签进行克隆，测序，分析,LongSAGE技术,传统的SAGE技术用14个碱基的标签代表一个基因并不能覆盖人类基因组内所有的基因序列，因而又发展了LongSAGE技术。LongSAGE标签来自转录物3端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相
3、匹配。其原理与传统的ShortSAGE方法类似，只是用了不同的S类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。,6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术,RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体中产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分为：平衡剪切；5选择性剪切；3选择性剪切；外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。 常用RT-PCR法（反转录PCR）研究某个基因是否存在选择性剪切。,RT-PCR：把RNA提取后反转录成cDNA，并以其为模板进行的PCR反应。,平衡剪切,5选择性剪切,3选择性剪切,外显子遗漏型剪切,相互排斥性剪切,一般用RT-PCR法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择
4、性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列。分析人类基因组数据发现60%的基因在表达中可通过选择性剪接产生各种形式的mRNA。,该基因编码一个神经无轴突定向受体，4号外显子有12个变异体，6号外显子有48个变异体，9号外显子有33个变异体，17号外显子有2个变异体。推测该基因共有1248332=38016剪接异构体。,6. 1. 3 原位杂交技术,原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，分为两大类：RNA原位杂交染色体原位杂交,RNA原位杂交：一般用
5、放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。,用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH),首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。,6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagene
6、sis),该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。迄今尚未建立用于精确预测特定氨基酸变化对整个蛋白结构及活性影响的模型，即使了解一个蛋白质的三维结构，也无法了解某个氨基酸残基对其的影响。而基因定点突变为进一步了解蛋白质的结构与功能的关系提供了重要的手段。,70年代初，Smith等建立了体外寡核苷酸介导的DNA 突变技术，提高了突变效率。,目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点 突变。重叠延伸
7、介导的定点诱变机制：,图6-7 重叠延伸介导的定点诱变机制,首先模板DNA分别与引物对1（正向诱变引物FM和反向引物R2）及引物对2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火，通过PCR1和2反应扩增出两种靶基因片段。,然后，在PCR3反应中变性后的FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火，按虚线所示进行延伸，形成全长双链DNA。,FMR2,RMF2,首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产生双链大引物（PCR1），与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA。,6. 2 基因敲除技术,
8、6. 2. 1 基本原理,经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型， 进而推导出该基因的功能。,基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶：通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。,基因敲除分为：完全基因敲除条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）完全基因敲除：指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性；条件型基因敲除：指
9、通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。,关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。,1、完全基因敲除：Neo基因有双重作用：形成靶位点的插入突变；作为正向筛选标记。,取代型,插入型,由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的重组概率约为10-210-5，植物的概率为10-410-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。所以，得用多种PCR及Southern杂交等多种分子筛选技术验证所获得的确实是目
10、的基因被敲除的细胞系。,2、条件型基因敲除：完全基因敲除往往导致胚胎死亡；而条件型基因敲除，由于具有可调节性而受到科学家的重视。特点：常将正向选择标记neor置于内含子中。,6. 2. 2 高等动物基因敲除技术,真核生物基因敲除的技术路线主要包括：构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中。使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。主要实验流程及筛选步骤：,模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。,胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),回交,显微注射筛选后的ES细胞,
11、注入母体,重组载体中的DNA整合到内源基因组中得以表达,将正向选择标记neor置于载体中,与ES细胞重组,筛选重组后的ES细胞,显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。,6. 2. 3 植物基因敲除技术,T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。,T-DNA：是农杆菌Ti或Ri质粒中的一段DN
12、A序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中，已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体，是Ti质粒上的片断。Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体。,报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。,a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB 是指载体上的一段 引物，目的基因片 段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b，PCR产物电泳结果。分别代表野生 型、杂合子和纯合 子PCR条带。,由T-DNA介导目的基因片段,LB为插入载体的引物,PCR产物电泳结果,整合,导致基因失活,已知序列,通过设计引物
13、分离靶基因,6. 3 蛋白质及RNA相互作用技术,6. 3. 1 酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。,将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription-activating domain, AD） 融合表
14、达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。,转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。,上游,下游,结构域,启动子,二者融合导入酵母细胞,图6-16 从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子基本流程示意图。,酵母单杂交体系主要用于：确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因；验证反式转录调控因子的DNA结合结构域；准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。由
15、于该方法的敏感和可靠性，已被广泛用于克隆细胞中含量极低且用生物化学手段难以纯化的那部分转录调控因子。,6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）,真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域。其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。,DNA结合结构域（BD）能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录。由不同转录调控因子的BD和DNA转录激活结构域AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。,
16、BD,AD,杂合蛋白,激活转录功能,6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉）技术及其应用,RNAi技术：利用设计的双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁法尔1998年在自然杂志上的论文。,RNAi作用机制示意图。,初始转录产物降解细胞内同源mRNA,双链小RNA,核酸酶,RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体,RISC介导切割,siRNA,mRNA被降解，翻译受抑制,研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA, single- stran
17、ded RNA）的降解。经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成2125个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），并有效地定位目标mRNA。,siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介。具有特殊的结构特征，即5端磷酸基团和3端的羟基，其两条链的3端各有两个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表
18、达的功能。,6. 4 基因芯片及数据分析,基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术，是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录的变化规律。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。,简易基因芯片,使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以 直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到 寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA 或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组 织或同一组织不同发育时期或不同生理条件 下的表达模式。,大规模基因芯片的应用,基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。,作业：,1、简述酵母单杂交系统的主要原理。2、简述酵母双杂交系统的主要原理。3、基因敲除技术,
