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1、mRNA差别显示技术,生工1班杨金鑫,主要内容,概述定义及原理应用及优缺点展望,高等生物大约有35 万个不同的基因，在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有10%20%的少部分基因被选择性表达，这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年来，该领域的研究取得了很大进展， 扣除杂交（subtractive hybridization, SH）、基因芯片技术（DNA chip technique）、基因
2、表达的系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体库技术(phage display antibody repertoire library technique)和双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis)先后成功地建立。,一. 概述,基因表达调控的一种方式。指在对信号或诱导物做出应答时，选择表达不同的基因，或使基因的表达水平有所不同。,基因差异表达,DD的发明及其基础,由Liang于1992年创立是分离差异表达基因强有力的工具在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更
3、适用、更简便基于RT-PCR理论，依赖于3种技术1）RT-PCR技术2）以特定引物进行的PCR技术3）DNA电泳技术,二.基本概念,mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。,反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细
4、胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检
5、测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。,反转录PCR,RNA指纹,RNA 首先在逆转录酶的作用下使RNA 逆转录为DNA，之后以其DNA 为模板，通过以DNA指纹技术建立指纹图谱进行分析。,DNA指纹,某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变反映出来，此即限制性片段长度多态性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度的酶切片段,水稻品种DNA指纹,基本原理,利用所有真核基因的mRNA 的3端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾结构的特点，将不同来源的总mRNA反转录合成
6、cDNA,此cDNA 合成是采用oligo(dT)12MN 为引物，其中M为A,C,G中的任意一种，N为A,C,G 或T 中的任意一种，共有12 种oligo(dT)12MN 引物，其中M为锚定碱基可增大引物的Tm值，N 称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12 种引物分别对同一总mRNA 样品进行cDNA 合成，即进行12 次不同的反转录反应，得到12种类型的cDNA，从而也将总mRNA分为12 个亚群。在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和相应的反转录引物PCR扩增，由于扩增的cDNA片段被放射性同位素标记，因而利用放射自显影技术通过对不同组织样品的同一类cDNA 的PCR 选择性扩增产
7、物进行凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上的组织特异性的表达。,基本原理是，几乎所有的真核基因mRNA分子的3-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三种不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5-T11G、5-T11
8、C、5-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个亚群体进行扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。,5,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3,Poly(A) RNA,5 T12MN 3锚定引物,逆转录,5,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3
9、,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,变性,5,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,退火,5 T12MN 3锚定引物寡核苷酸随机引物,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,延长,dNTP、Taq聚合酶,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,5,MNAAAAAAAAAAA 3,变性、退火、延伸,电泳,显示,T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C),启动cDNA第一链合成,不同长度的PCR产物,回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对,随机结合到cDNA链上,(1) 提取总RNA，在这个步骤中注意不能有DNA污染，一般用无RNA
10、酶的DNA酶在37下处理30 min；(2)在逆转录酶作用下，以Oligo T11MN 为引物(M为G、A、C中的任一种，N为A、C、G、T任一种)，进行逆转录；(3)PCR反应，扩增cDNA的第一条链；(4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开；(5)找出不同处理间差异显示的条带，从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增；(6)克隆差异片段，差异片段可作为探针；(7)Northern 杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；(8)对目的片段进行测序；(9)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。,技术一般步骤,mRNA差异显示技术
11、简略流程图,放射性自显影技术,放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射线使照相乳胶“感光”，再经显影和定影处理，将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金属银，洗去未“感光”的卤化银后则图像自然显示出来。图像中任何区域的黑度取决于留存的金属银的量，它反映了射线在这个区域所沉积的能量。记录、检查和测量整体和组织、细胞和亚细胞水平中放射性示踪物的分布、进行定性和半定量测定，称为放射自显影法。,DD的优点,以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础灵敏度高，仅需0.2g的总RNA因为从两种或更多的特定组织样品来源的扩增产物在同一块胶上鉴定，因此能用于鉴定特定组织
12、或细胞来源样品之间转录水平的mRNA的定性和定量变化可以同时检测到“上调”及“下调”的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析,DD的缺点,每种技术的诞生都不可能是完美的，mRNA差异显示技术虽然从创立时起就很受欢迎，但是许多研究者发现该技术存在一定缺陷，其中三点较为突出：第一，操作步骤多，外源DNA污染严重而导致假阳性率高，即差异片断用Northern杂交时无阳性信号，重复稳定性较差。据研究，这种假阳性率可高达70第二，获得的差异条带短小，多为300bp左右，并且多为3端非编码区序列（UTR），难以直接判断其功能和意义。第三，必须采用放射性同位素标记反应，使得实验周
13、期长、成本高、易造成同位素污染，且不好回收差异片断。,（）用无酶的酶处理总，防止污染。（）使用酶时，批号应相同，不要经常调换。（）循环次数减至次，提高退火温度，减少非特异性条带。（）把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆。（）改变引物长度，如有的在端锚定引物和端各加上个碱基，带上双酶切位点，如此可显著提高重复性,改进方法,三.mRNA差异显示技术的实际应用,mRNA差异显示技术现在已经成功运用于动物的胚胎发育、组织分化、生长因子激活与抑制、细胞周期控制、癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆，在植物无性繁殖、形态发生、次生代谢、抗逆抗病等方面被用来进行
14、基因的鉴定、克隆以及功能研究，并取得很好的结果。概括起来其主要用途可以归纳为以下三点： 第一，寻找差异表达的基因。 第二，研究个体、种群或品种间转录水平上的遗传变异。 第三，鉴定经济动物中控制重要数量经济性状位点的基因。,基因的鉴定与克隆,差异显示技术目前已成为鉴定和克隆基因的重要方法。等利用一对近等基因系，研究了西红柿基因组特异区。这对近等基因系中有一个含有抗烟草花叶病毒（）抗性基因，一个不含。这两个近等基因系有一个差异片段，克隆后经杂交证实是阳性克隆，并且发现，这个片段与抗性有密切关系。利用修饰的差异显示法克隆了小麦基因族的个公认的基因，他认为差异显示法在很短时间内就可以克隆基因。和克隆了
15、水稻的赤霉素调控基因，利用赤霉素处理水稻，一个诱导，一个不诱导，发现二者在差异显示时，表达量相差倍，因而很容易克隆了一个赤霉素调控基因。和利用差异显示法，分析了拟南芥对臭氧的反应。拟南芥用臭氧处理后，在根和成熟花中，臭氧诱导的转录物含量极高，是叶的倍。序列分析证明，编码一个蛋白多肽，其序列与已知的蛋白序列基本一致，充分表明差异显示方法是克隆基因的有效方法。赵大中等比较春化过和不春化的小麦，发现春化的小麦有一个与春化相关的克隆，经杂交和同源性分析，证明是春化特异克隆片段，该克隆片段的基因对春化需求型植物的成花诱导起重要作用。,研究激素对植物发育的影响,在植物的发育过程中，激素自始至终起着作用，调
16、控着植物的器官形成、生长发育。研究其作用具有重要意义。Peters等发现，用玉米素处理红叶藜的细胞时，mRNA表达量迅速增加，从而使细胞分裂加快。Chen等发现，用赤霉素处理水稻幼苗，然后采用mRNA差异显示技术，处理过的幼苗中mRNA有特异的差异带(UBCgene)。克隆此片段，发现此片段影响基因调控过程中的某些蛋白。瞬时表达分析表明，该序列位于启动子转录起始位点上游231159碱基位置；另外，还发现UBC gene可促进-淀粉酶基因表达，从而调节水稻幼苗发育。,研究抗病机制,植物病害每年都使农作物受到大量损失，因此提高农作物的抗病能力不仅有利于减少损失，而且有利于减少农药使用和环境污染。目
17、前研究植物抗病机理主要方法是探讨植物微生物的相互作用机制。Benito等18通过研究西红柿真菌病害，利用差异显示法对抗病机理进行了探索。他们发现，健康的番茄叶和被真菌或烟草枯斑病毒侵染的番茄叶的mRNA有较大差异。在病菌侵入后，植物防卫基因会迅速产生一系列mRNA，产生蛋白与病原菌相互作用，杀死病原菌或病毒。在相互作用过程中，有3个mRNA片段(ddB-2，ddB-5，ddB-47)大量积累，但相互作用后，则很快消失。这表明，植物的抗病与某些防卫基因的瞬时表达有密切关系。,DD的展望,由于人们认识的基因还不够全面，特别是对生物发生、发育及病理生理过程中某些新的功能基因和调控作用认识不足，因此差异显示技术将在研究生物进化、损伤修复、癌变及治疗反应过程中具有重要意义。差显技术的发现为在该领域中寻找新基因提供了有用的工具。相信随着不断的应用和技术的不断改善，差异显示技术必越来越多的在生命科学以及医学领域的基因鉴定、克隆等方面起到更大的作用，对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要作用。 经过近几年的研究，在提高重复性，降低假阳性方面有所改进，尤其mRNA 差异显示试剂盒的商品化，为mRNA 差异显示提供了成套试剂，mRNA 差异显示技术将会越来越广泛的应用于生命科学的研究。对进一步揭开基因表达调控的奥秘，将发挥越来越大的作用。,
