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1、,双水相萃取技术,萃取是最常用的一种液液分离方法，在制药和化工行业应用极为普遍。但是普通的有机溶剂萃取法由于以下原因难于应用于蛋白质分离：(1)许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶 剂；(2)蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。,1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶 性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A等人首先将双水相系统应用于萃取技术。70年代，德国将此技术应用于从细胞液中提取酶和蛋白质，大大改善了酶的提取效果。目前，仍然停留于
2、实验室阶段，没有一套完善的理论来解释生物大分子在体系中分配机理。工业化的例子不多，原因在于成本过高，使技术上的优势被削弱。,双水相萃取法是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。双水相系统可将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中。,2.2的葡聚糖水溶液与等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层，下层含有大部分葡聚糖上层含有大部分甲基纤维素纳，两相中 98以上的成分是水。,一、双水相的形成,互不溶性，形成两个水相，两种聚合物分别富集于上下两相；复合凝聚，也形成两个水相，但两种高聚物主要集中于一相。另一项几乎为水；完全互溶形
3、成均相的高聚物水溶液。,高聚物水溶液的混合,双水相系统的形成在于聚合物的不相溶性产生的空间障碍作用。两个亲水成分的非互溶性，通常来源于各自分子结构上的不同所产生的相互排斥作用。相反两种高聚物如果产生引力则会形成互溶或者复合凝聚。双水相系统也可由聚合物和无机盐之间。只要浓度达到一定值，也 会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理尚不清楚，一 种解释为“盐析”作用。,双水相形成机理,一、双水相的形成,不相溶性是一普遍现象，其溶剂也不一定是水，也可能是有机溶剂。如果多种不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相体系，如硫酸葡聚糖、葡聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二醇相混时，可形成四相体系。 与溶剂萃取比较，
4、双水相的两相性质差别小（密度和折射率），有时难以看到界面。,生化工程中广泛应用的双水相体系：聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖(Dex)体系，PEG/盐等体系。 分离某一生物大分子，两相系统的选择必须有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。如甲基纤维素和聚乙烯醇，因其粘度太高而限制了它们的应用。 PEG和Dex团其无毒性和良好的可调性广泛应用。,二、相平衡和混溶性,相图,M,A,T,B,B,精确配制43.00%（g/ml）左右的(NH4)2SO4溶液，并测其密度。精确称取PEG 400溶液0.700g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5 mlH2O（H2O的密度以1
5、g/ml计）缓慢滴入已配制好的(NH4)2SO4溶液，并不断在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现混浊为止。记录(NH4)2SO4的加量（ml），根据密度值求出重量（g），然后，按下表所列的第2号数据加入H2O，使其澄清（加H2O量根据数据点的密集程度控制），继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到混浊，如此反复操作，计算每次达到混浊时，PEG和(NH4)2SO4在系统总量中的重量百分比（%），将PEG的百分浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的百分浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。,相图的制作,Co,CT,CB,物质在两相中的分配 和溶剂萃取法一样，物质在
6、两水相中的分配用分配系数K 表示。 K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关， 与溶质的浓度无关,影响分配平衡的参数 影响分配平衡的主要参数有成相聚合物的分子量和浓度、体系的pH、体系中盐的种类和浓度、体系中菌体或细胞的种类和浓度、体系温度等等。选择合适的条件，可以达到较高的分配系数，较好地分离目的物。 (1)聚合物的影响,(2)体系中无机盐离子的影响 在PEG/DEX体系中，无机盐离子在两相中也有不同的分配，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。,H=6.9溶菌酶带正电，卵蛋白带负电。,此性质常被用于提高物质在双水相系统的分配
7、系数。,(3)体系pH的影响 pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，影响相间电位差，从而影响分配系数。pH微小的变化有时会使蛋白质的分配系数改变2-3个数量级。,(4)体系温度的影响 温度影响相图，同时影响分配系数和蛋白质的生物活性，它主要是影响相的高聚物组成。临界点附近，温度对分配率的影响较大。远离临界点时，影响较小。 一般地，双水相萃取主要在室温附近操作。,(5)体系中微生物的影响 对于双水相体系，微生物也会影响体系上下相的比例以及胞内蛋白质在体系的分配系数。 这种分配的差异主要是由细胞破碎程度引起的，细胞壁和
8、细胞膜不同的化学结构也会导致体系上下比例的改变。,随着细胞浓度的增 加，细胞破碎后释放的内含物的分配系数迅速下降。,同时，PEG是一种常见的絮凝剂和沉淀剂，在该体系中，细胞物质的絮凝和在不同相中的分配同时发生。所以PEG 的存在改变了物质的溶解曲线。,双水相萃取技术的应用,要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件： (1)欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中； (2)酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时 一次萃取，就能得到较高的收率； (3)两相用离心机很容易分离。,双水相萃取技术的发展,廉价双水相体系的开发,两种双水相体系的比较,变性淀粉PPT代替昂贵得葡聚糖。,2. 双水相萃取技术同其他分离的结合，提高分离效率与亲和层析相结合亲和双水相同生物转化相结合,习 题,凝聚： 絮凝： 分配系数（液液萃取）：分离因数：说明超临界流体萃取的优势有哪些？ 说明双水相萃取的优势有哪些？,
