生物制药工艺技术基础课件.ppt

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1、生物制药工艺技术基础,章节提要,第一节 生化制药工艺技术基础一、生物材料与生化活性物质二、生化活性物质的提取三、生化活性物质的浓缩与干燥四、生化活性物质的分离与纯化第二节微生物制药工艺技术基础(重点）一、微生物菌种的选育与菌种保藏二、微生物的培养三、发酵过程的控制第三节 生物技术制药工艺技术基础（自学）,第四节 生物制药中试放大工艺设计一、生物制药中试放大工艺设计二、中试放大方法与内容第五节 生物药物的研究与新药申报一、生物药物的研究开发过程二、生物药物的新药申报,1 生化制药工艺技术基础,天然生化药物：是以人体组织、动物、植物、微生物和海洋生物为原料，应用生物化学的原理、方法与生物分离工程技

2、术加工制造的一大类天然生物药物。特点：来源广，疗效好，几乎无副作用。,1.1 生物材料与生化活性物质,1.1.1 生物材料来源动物脏器血液海洋生物植物微生物生物新资源, 动物脏器来源,胃粘膜：胃蛋白酶、凝乳酶等。,肝脏：肝RNA、造血因子、肝脏解毒素。,血液、分泌物和其他代谢物来源,海洋生物来源, 植物来源,生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、挥发油氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素等。如：木瓜木瓜蛋白酶 菠萝菠萝蛋白酶 人参人参多糖 黄芪黄芪多糖,微生物来源,生物新资源,动植物细胞大规模培养基因重组技术构建“工程菌”、“工程细胞”转基因动物、植物,eg. 植物转基因疫苗,找出编码抗原蛋白的

3、基因,转入载体质粒,转入土壤杆菌,转染植物细胞,整合到细胞染色体中,生成新植株,eg. 动物乳腺生物反应器,上海交大医学遗传研究所研究构建了30多种乳腺特异表达载体，如大鼠、羊、奶牛等。,1.1.2 生物材料的准备,.一、生物材料的选择有效成分含量高；原料新鲜、无污染；来源丰富；价格低廉；杂质少。二、生物材料的采集、预处理与保存材料采摘及时、完整，低温保存。保存方法：冷冻法、有机溶剂脱水法、防腐剂保鲜法。,1.2 生化活性物质的提取,（一）常用提取方法酸、碱、盐水溶液提取法表面活性剂提取法与反胶束提取法有机溶剂提取法双水相萃取法超临界萃取技术,酸、碱、盐水溶液提取法,提取各种水溶性、盐溶性的生

4、化物质。应用举例：雄鸡冠中透明质酸的提取相关实验项目：银耳多糖的提取、细胞色素C的提取,丙酮脱水鸡冠,提取液,水相,水（提取）,氯化钠，氯仿（除蛋白）,沉淀物,乙醇（沉淀）,透明质酸粗品,（脱水、干燥）,表面活性剂提取法,常用：SDS，Tween、Span系列等非离子表面活性剂。原理：增溶、乳化、分散,有机溶剂提取,分为固-液提取和液-液萃取两大类。（1）固-液提取常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等。溶剂选择原则：“相似相溶”常用：甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙醚、三氯甲烷丙酮：脱水、脱脂（丙酮粉）相关实验项目：蛋黄中卵磷脂的提取,有机溶剂提取应用举例,应用举例：冻胰中胰岛素的提取,粗制

5、冻胰,胰片,酸醇提取液,刨碎,乙醇（87%左右、2.3-2.6倍；草酸（5%）,pH2.5-3,13-16,（2）液-液萃取,利用溶质在两个互不相溶的溶剂中溶解度的差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响因素：pH、盐析、温度、乳化溶剂选择：K值、易于回收、安全价廉。eg：青霉素的提取浓缩,双水相萃取法,双水相萃取法：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。针对蛋白质易失活；部分蛋白质具较强亲水性，不溶于有机溶剂。类型：聚合物聚合物水系统：空间阻碍作用聚合物无机盐水系统：盐析作用,超临界萃取技术,超临界流体萃取技术：利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所

6、具有的特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技术。,超临界流体性质,密度与液体相当萃取能力强黏度接近气体传质性能好扩散系数介于气体和液体之间。比液体大数百倍。,超临界流体萃取的基本思想,利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下与待分离物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得以分离,CO2超临界流体,物料,萃取,降压,升温,CO2流体,萃取物,1.2.2 影响提取效率的因素,温度耐热生化成分：50-90；不耐热：0-10；一般20-25酸碱度：一般49，避免在等电点附近提取盐浓度：“盐析”，“盐溶”作用,1.2.3 提取方法的选择,针对生物材料和目的物得性质选择合适溶剂系

7、统与提取条件。考虑因素：溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、含量、杂质种类及相关性质等。选择依据：文献参考、试验探索,eg.胸腺素的提取,结构性质：80热稳定的40-50种多肽组成的混合物，分子量1000-15000，等电点3.5-9.5分离工艺：,胸腺,胸腺碎块,提取液,上清液,丙酮粉,上清液,盐析物,超滤液(M15000,胸腺素,绞碎,捣碎、提取生理盐水,加热去杂蛋白80，15min,沉淀丙酮-10,H7磷酸缓冲液、硫酸铵、饱和度0.25,硫酸铵、饱和度0.5，pH4,超滤PH8,脱盐、干燥,1.3 生化活性物质的浓缩与干燥,1.3.1 浓缩方法：盐析浓缩有机溶剂沉淀浓缩葡聚糖凝胶

8、浓缩聚乙二醇浓缩超滤浓缩真空减压浓缩与薄膜浓缩,盐析浓缩,添加中性盐使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀，从而达到浓缩目的。常用盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等,有机溶剂沉淀浓缩,加入有机溶剂使生化物质溶解度明显降低而沉淀析出的方法。优点：不必除盐、溶剂易回收缺点：可能造成蛋白质变性,葡聚糖凝胶浓缩,聚乙二醇浓缩,聚乙二醇,样品溶液,透析袋,超滤浓缩,应用不同型号超滤膜浓缩不同分子量的生物大分子。, 真空减压浓缩与薄膜浓缩,优点：蒸发温度低、速度快,1.3.2 干燥,使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或他种溶剂，从而获得干燥物品的过程。目的：提高药物或药剂稳定性，利于保存和运输使药物或制

9、剂有一定规格标准便于进一步处理,干燥方法,减压干燥喷雾干燥冷冻干燥,减压干燥（真空干燥）,密闭容器中抽去空气后进行干燥的方法。加速干燥、降低湿度、使干燥产品疏松和易于粉碎，提高产品质量,箱式真空干燥机,双锥真空干燥机,喷雾干燥,待干燥物质经浓缩成一定浓度的液体后经设备喷雾后形成极大表面，在短时间内干燥的技术。,喷雾干燥流程,冷冻干燥,低温低压条件下、利用水的升华性能而进行的一种干燥方法。,1.4 生化活性物质的分离与纯化,1.4.1 生化制药工艺中分离制备方法的特点生物材料组成复杂化合物含量低生物活性成分稳定性差溶液各参数对组分影响难以预估逐级分离方法操作时间长，工艺复杂,1.4.2 分离纯化

10、基本原理,根据分子形状和大小不同进行分离：膜分离、超滤、凝胶过滤、差速离心根据分子电离性质的差异：离子交换法、电泳法根据分子极性大小及溶解度不同：溶剂提取法、盐析法、有机溶剂沉淀法根据物质吸附性质的不同：吸附层析根据配体特异性：亲和层析,1.4.3 分离纯化方法设计基本程序,确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法制备物的理化性质和稳定性的预备实验材料处理及抽提方法的选择分离纯化方法的摸索产物的均一性测定,2 微生物制药工艺技术基础,菌种获得途径：自然选育、人工诱变2.1 菌种的选育与保藏2.1.1 菌种的分离与筛选菌种的分离：收集富集培养分离纯化菌种的筛选：文献参考、经验参考,2.1.2

11、 菌种的选育,选育手段：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程技术选育目的：提高发酵产量改进菌种性能产生新的发酵产物去除多余的组分,（1）自然选育,自然选育：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程。以达到稳定和提高生产能力的目的。优点：简单易行缺点：效率低、进展慢自然突变频率仅10-6-10-10左右。,自然选育的一般过程,生产菌种斜面制备单孢子（或细胞）悬浮液涂布平板、培养后挑取单菌落斜面种子培养摇瓶发酵高产菌株初选菌种保藏斜面种子培养摇瓶种子培养摇瓶发酵高产菌株复选高产菌株验证,初筛,复筛,（2）诱变育

12、种,诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。优点：速度快、收效大、方法简单,诱变的主要环节,出发菌株的选择诱变处理突变株的筛选,出发菌株的选择,纯种,性状优良,诱变敏感,适宜发育时期,诱变处理（重点）,诱变剂的选择：防止诱变效应饱和。诱变剂用量的选择：高致死剂量、中等剂量影响诱变效果的因素：菌种生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件、诱变处理时外界条件等。,诱变剂,出发菌株的培养,孢子悬液或菌悬浮液的制备,紫外线照射,后培养,稀释涂平板,eg. 紫外线诱变过程,eg. 亚硝基胍诱变处理

13、方法：制备菌悬液配制NTG母液NTG与菌体的作用NTG作用的终止稀释涂平皿,13mg/ml、30120min、2632,生理盐水洗涤菌体，离心后重新制备菌悬液,突变株的筛选,筛选：将分离培养后的各型单菌落中性状优良、具有高发酵能力的突变菌株挑选出来过程。初筛：从大量菌株中发现有苗头的优良菌株，筛选量大，准确度要求不是很高。复 筛：注重准确性和可重复性。一支菌种要接种35个发酵摇瓶，采用二级发酵，力求试验结果准确可靠,筛选方法,随机筛选：随机挑选平板分离后的单菌落，从中筛选具有优良性状的菌株。理性化筛选,摇瓶筛选,琼脂块筛选,摇瓶筛选法,操作步骤,平板分离单菌落,接种斜面培养,摇瓶发酵,测定生物

14、活性物质含量,高产菌株的筛选,初筛复筛,琼脂块筛选法,b 理性化筛选：根据产物已知或可能的生物合成途径、代谢调控机制和分子结构设计的一些筛选方法。打破微生物原有代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。,突变株中高丝氨酸脱氢酶失活，不能合成高丝氨酸，使其全部用于赖氨酸的生物合成，有利于赖氨酸的合成。,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,高丝氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,丙酮酸,异亮氨酸,天冬氨酸激酶,反馈抑制,赖氨酸,高丝氨酸脱氢酶（HD）,争夺底物，解除反馈抑制,高丝氨酸的营养缺陷型突变菌株,（3）杂交育种,杂交育种：将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选

15、具有新性状菌株的过程。,杂交过程,两亲本菌株细胞间接合染色体部分转移形成部分结合子交换、重组重组体的产生,接合：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质从供体菌转移给受体菌。,（4）原生质体融合育种,原生质体融合技术（P68）：把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca+作用下，发生原生质体的融合，促使两亲本的遗传物质进行交换，从而实现遗传重组。在适宜条件下，进行融合细胞的再生，获得具有新的遗传性状的重组菌株。,原生质体融合,（5）基因工程技术,将某一生物体（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一微生物体（受体）细胞中，使外源DNA片段在后者

16、内部得以表达和遗传。,eg. 人胰岛素生产的原理,2.1.3 菌种的保藏,目的： 不死亡 不生长、不污染使菌种： 不降低或不丧失其优良性状 以尽延长其使用时间意义：有利于基础研究和实际应用原理 根据微生物的生理特征，人为地创造不利于微生物的生长条件，使微生物处于代谢不活跃，生长繁殖受抑制地休眠状态，减少菌种地变异。,菌种保藏的方法,斜面保藏法液体石蜡保藏法砂土管保藏法麸皮保藏法冷冻干燥保藏法液氮超低温保藏法甘油保藏法孢子滤纸保藏法,斜面保藏法：,菌种接种于适宜斜面培养基中或进行穿刺培养，菌体生长成熟后，放入4冰箱保存。间隔一定时间需重新移植培养。保藏时间：放线菌46、3个月，酵母菌46个月优点

17、：简单方便，成本低，能随时观察菌株是否死亡、变异、退化或染菌。缺点：变异、退化、染菌几率增大广泛用于细菌、放线菌、酵母菌等的短期保存。,液体石蜡保藏法（矿油保藏法）,用石蜡覆盖生长丰满的斜面菌种上。加塞并用石蜡封口，直立低温保存。,石蜡灭菌、烘干,倾注或移入生长成熟、丰满的斜面菌种上,加塞并用固体石蜡封口、直立低温保存,0.1Mpa,3060min16012h,特点：防止水分蒸发，隔绝氧气，降低微生物代谢，延长保存时间，效果更好。缺点：占空间较大；容易造成生产力降低；不适合以石蜡为碳源的微生物。,菌种保藏期间要定期做存活率和活性试验，一般2-3年一次。,冷冻干燥保藏法,将菌液在冻结状态下升华其

18、中的水分，获得干燥的菌体样品。优点：保藏期长，变异小、适用范围广。缺点：操作烦琐、技术要求高、需冷冻干燥设备,冻干管,液氮超低温保藏法,操作方法：配液：将浓的菌悬液加入灭菌的保护剂中，分装到安瓶中（0.2-1ml）封口冷冻：至-25左右放入液氮罐中。在-150- -196保藏。解冻：快速解冻，将安瓶立即放在38-40温水中震荡1-2min，有利于细胞复苏。优点：操作简便、高效，适合各种微生物。保藏时间长。缺点：需购置超低温液氮设备，液氮消耗量多，操作费用较高。,10甘油、5二甲基亚砜,液氮保藏管,液氮罐,甘油保藏法,保藏方法：将拟保藏菌种的对数期培养液直接与经121蒸汽灭菌20min的甘油混合

19、，使甘油浓度在1015%，再分装于小试管中，低温冰箱保藏。保藏时间：-20可保藏0.51年；-70可达10年。特点：操作简便、保藏期长，需超低温冰箱。,其他干燥保藏法,沙土管保藏法、麸皮保藏法等。,课堂练习,一 连连看二 填填看（1）不利于微生物生长繁殖的条件有（ ）（ ）（ ）（ ）低温/缺氧/干燥/寡营养（2）冷冻干燥保藏法使用（ ）或（）作为保护剂。甘油/二甲基亚砜三 说说看液氮保藏菌种在复苏时有什么特别要求。哪些菌种保藏方法适合专业机构进行菌种保藏，哪些又适合发酵企业进行菌种保藏，为什么？,2.2 微生物的培养,2.2.1 培养基：人工配制的、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需

20、的多种营养物质的混合物。,2.2.2 培养基的种类,按组成物质来源：合成培养基、复合培养基按物理状态：固体培养基、液体培养基 按工业发酵中的用途：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基、补料培养基。, 按组成物质分类,课堂讨论,PDA培养基 配方：（g/L） 马铃薯粉 6.0 葡萄糖 20.0 琼脂 20.0 pH值 5.60.2 25 适用于酵母菌的培养,LB培养培养基。配方：（g/L） 胰蛋白胨 10.0酵母提取物 5.0氯化钠 10.0 蒸馏水 若干适应于细菌的培养,试判断这两种培养基的类型？, 按形态分类,固体培养基：加入一定凝固剂（琼脂）的培养基。适用于：菌种培养、分离、菌种保藏。,液体

21、培养基：未加任何凝固剂的培养基。可通过振荡和搅拌，有利于营养物质的均匀分布和氧的传递适用于：大规模工业生产和实验室研究。,按工业用途分类,按工业用途分类,影响培养基质量的因素,原材料质量水质灭菌培养基黏度,发酵用水：深井水、地表水、自来水、蒸馏水等。水源质量考察参数：pH、溶氧、可溶性物质、污染程度、矿物质组成和含量。,高压蒸汽灭菌，121、2030min灭菌不当造成影响：破坏营养成分；营养物质发生反应，造成营养成分损失；产生有害物质。,影响氧传递和微生物的氧利用度，对分离提取造成不便。,2.2.3 灭菌和除菌,一、灭菌方法高温灭菌,5,热空气灭菌柜,纯蒸汽灭菌柜,蒸汽灭菌锅,过滤除菌：微孔滤

22、膜（0.2um/0.4um）或纤维介质等。 澄清流体的除菌（氨水、丙醇、空气等）化学物质消毒和灭菌：甲醛、乙醇、苯酚、季胺盐等； 厂房等空间、皮肤消毒。,其他灭菌方法辐射灭菌210230nm紫外线、0.0060.14nmX射线等。臭氧灭菌静电除菌,二、培养基的灭菌方法（掌握）,（1）实罐灭菌（实消）将配制好的培养基输入发酵罐内，经过间接蒸汽预热，然后直接通入饱和蒸汽加热，使培养基和设备一起灭菌，达到要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。温度：121时间：30-60min,（2）空罐灭菌（空消）发酵罐体的灭菌。罐压：1.5-2个大气压温度：125-130时间：30-45min,

23、（3）连续灭菌（连消）：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺。优点：高温、快速灭菌，营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，容积利用率高；热能利用合理；蒸汽用量平稳但压力高。缺点：不适用黏度大或固型物含量高的培养基灭菌；需连续灭菌设备，投资较大，增加中间环节。,2.2.4 微生物的培养方法,微生物培养：将微生物接种于培养基中，在特定条件下增殖的过程。培养装置：恒温箱、震荡培养器、发酵罐等,培养方法,固体培养法：斜面培养、平板培养、穿刺培养、其他（米曲、面包等）固体培养法。液体培养法：静止培养法、震荡培养法,2.3 发酵过程的控制,（一）发酵参数控制

24、目的：取得理想发酵效果、得到高产优质发酵产物。先决条件：了解发酵过程进行的状况控制手段：发酵罐内取样分析获得有关信息，进而根据发酵状况作出调整。通过取样分析获得的有关发酵的信息也称为参数，可分为物理、化学和生物三类。,（一）物理参数,（1）温度：影响酶活、溶氧量和发酵液的物理性质（2）压力：防止外界杂菌侵入；增加氧气饱和溶解度。通常控制在0.020.05MPa。（3）搅拌转速：指搅拌器在发酵过程中的转动速度。转速高低影响发酵液中液相体积氧传递系数、发酵液的均匀性和发酵液中泡沫的程度。,（一）物理参数,（4）搅拌功率：搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率。一般24（KW/m3

25、）（5）表观黏度：与发酵液中菌体浓度、菌体的形态和培养基成分有关。单位：PaS,（一）物理参数,（6）空气流量：单位时间内向发酵罐中通入空气的量。影响液相体积氧传递系数KLa、代谢废气的排出，发酵液中泡沫的生成。通气量的表示方法：绝对流量（P136）：单位时间内通入发酵罐中无菌空气的体积（L/min）相对流量：每分钟、单位体积发酵液中通入无菌空气的体积，大多数需氧菌发酵通气量0.81.5V/（Vmin）,（二）化学参数：,（1）pH值（2）基质浓度糖浓度氮浓度磷酸盐含量产物浓度溶解氧浓度废气中氧含量废气中二氧化碳含量,（1）pH值,发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。与菌体生长和产物

26、合成有着重要关系，pH的变化反应菌体代谢状况，长时间pH过低，还可能是发酵染菌的结果。,（2）基质浓度：,发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。对生产菌的生长代谢有重要影响。1、糖浓度的测定：总糖水解法；还原糖斐林试剂法2、氮浓度的测定：总氮：发酵液中含有氮元素总量和，包括了发酵液中所有以各种形式存在的氮元素的总量。测量时以强酸水解，将含氮化合物中氮元素释放出来，以凯式定氮法测定。氨基氮：以氨基酸形式存在的氮元素，采用甲醛法测定。3、磷酸盐含量测定：钼酸铵比色法,4、产物浓度测定：判断代谢是否正常，决定放罐依据。氨基酸（g/l）、抗生素（效价单位）5、溶解氧浓度的测定：了解产生菌对氧利用的规

27、律，发现发酵异常情况，也可作为发酵中间控制的参数及设备供氧能力的指标。用绝对氧含量（mmol/L或mg/L）表示。,6、废气中氧含量：算出产生菌的摄氧率。7、废气中CO2含量：算出产生菌的呼吸熵，了解产生菌的代谢规律。,（三）生物参数,菌体浓度菌丝形态,菌体浓度,控制微生物发酵过程的重要参数，特别是对抗生素等次级代谢产物的发酵控制。意义：菌体量的大小和变化速度对合成产物的生化反应有重要影响；菌体浓度与培养液表观黏度有关，间接影响发酵液溶氧量；为补料和供氧提供依据。,菌丝形态菌丝形态的变化可反映菌体的生长阶段和菌体内代谢变化。,菌丝的形状：了解菌体所处生理阶段和代谢状况菌丝的粗细：反应菌体生长代

28、谢是否旺盛染色的深浅：反应菌体代谢状况。脂肪颗粒：菌体胞内营养贮存物，与菌体生理阶段有关。空泡：反映胞内DNA含量的变化。,（二）发酵过程的变化规律与控制,按发酵过程中投料方式的不同，可将发酵分为分批发酵补料分批发酵连续发酵,分批发酵 指一次性投入料液，发酵过程中不补料，一直到放罐的发酵过程。特点微生物所处的环境在不断地变化，其物理、化学和生物学参数都随时间而变化，是不稳定的过程,补料分批发酵 是在发酵过程中一次或者多次补入含有一种或多种营养成分的新鲜料液，以达到延长发酵周期，提高产量的目的。优点： 可延长发酵周期，提高产量 可避免高浓度营养物对代谢产物生物合成的抑制作用 缺点：发酵工艺复杂,

29、连续发酵是在特定的发酵设备中进行的，一边连续不断的输入新鲜无菌料液同时连续不断的放出发酵液。罐式连续发酵管式连续发酵,（三）发酵过程的重要影响参数与控制,1、温度的影响与控制Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q显Q辐射温度对发酵的影响影响酶的活性影响发酵液的物理性质：影响代谢产物合成的方向发酵温度的控制： 可通过冷却设备进行降温。,2、 pH的影响及其控制,适宜大多数微生物生长的pH3-6，变化范围0.5-1pH上限：8.5 pH下限：2.5pH对发酵的影响：影响酶活影响基质或中间产物的解离状态：物质透膜速度不同，代谢速度不同。影响发酵产物的稳定性,发酵pH的控制,调整发酵培养基的组成：通过补料控制：在

30、发酵培养基中加入pH缓冲剂；改变发酵条件：直接加酸、碱调节,3、溶解氧的控制,大多数发酵类型：需氧发酵C6H12O6+6O2 6H2O+6CO2能量溶氧控制关键：供氧=需氧,4、二氧化碳的影响与控制,CO2的影响：降低发酵液pH、抑制微生物生长和发酵、与其他物质生成沉淀等影响CO2的因素：菌体呼吸强度、发酵液性质、通气搅拌、设备等。控制方式：加强通气搅拌、加碱中和、罐压调节,5、泡沫的影响及其控制,泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系，气液之间被一层液膜隔开，彼此不相联通。 类型：机械性泡沫：存在于发酵液表面上面的泡沫。气相比例大，与液体有明显界限。流态泡沫：存在于发酵液中的泡沫，分散在发酵

31、液中，较稳定，与液体之间无明显界限。,泡沫对发酵的影响,影响发酵罐的装料系数，降低发酵产量泡沫过多容易造成逃液，发酵液溢出，增加染菌机会。影响气体的交换和氧的传递部分发酵液粘附于罐壁失去作用，影响放罐体积和产量泡沫严重时，被迫停止搅拌或通气，容易造成菌体缺氧，导致代谢异常。,泡沫的控制,机械消沫：利用强烈机械震动或压力变化而使泡沫破裂。如安装消沫桨。消沫剂消沫： 常用消沫剂（熟悉）：天然油脂（豆油、玉米油等）、高碳醇或酯类（PEG等）、聚醚类及硅酮类,案例：青霉素的发酵生产,冷冻管,母斜,大米孢子,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,放罐,提炼,孢子培养,25，6-7d,种子培养,25，40-45

32、h1:2L/(Lmin）,种子培养,25，13-15h1:5L/(Lmin）,孢子培养,25，6-7d,发酵,22-26，6-7d1:（1-0.8）L/(Lmin）,冷却至15,菌种：丝状黄青霉菌种子制备：孢子培养：母斜、米孢子培养基：碳源（淀粉酶解的葡萄糖化液流加）；氮源（玉米浆、花生饼粉）前体（苯乙酸或苯乙酰胺）发酵控制：pH:6.4-6.6温度：前期25-26，后期23通气：1：0.8L/(Lmin)消沫：天然油脂（已淘汰）、化学消沫剂（泡敌）,4 生物制药中试放大工艺设计,中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否进入规模化生产至关重要。一、生物制药中试放大工艺特点

33、4.1 中试放大实验目的提供工艺条件和参数提供足量合格产品拟定符合GMP要求的制造规程与检定规程,4.2 进入中试应具备的条件,收率稳定、质量可靠操作条件已经确定，产品、中间体及原料的分析方法已经制定生物材料的资源已确定并已系统鉴定进行过物料平衡，“三废”问题已有初步处理方法提出中试规模及所需原辅料的规格和数量提出安全生产要求,工艺条件关键问题,1、原辅料规格的过渡实验2、设备选型与材料质量实验3、反应条件限度实验4、原辅材料，中间体及产品质量分析方法研究5、下游工艺研究,二、中试放大方法与内容,（一）中试放大方法：经验放大法、相似放大法、数学模型放大法。经验放大法：凭借经验通过逐级放大（实验

34、装置、中间装置、中型装置和大型装置）来摸索反应器的特征。,中试放大内容：,工艺路线与各步反应方法的最后确定设备材质与型号的选择反应器的规模选择及反应搅拌器形式与搅拌速度的考查生产反应条件的研究工艺流程与操作方法的确定物料衡算安全生产与“三废”防治措施研究原辅材料、中间体的物理性质和化工常数的测定原辅材料、中间体质量标准的制定消耗定额、原料成本、操作工时与生产周期等的计算,5 生物药物的研究与新药申报,生物药物研究开发过程：（一）制定研究计划和制备新化合物阶段调查研究，收集资料，整理文献，制定计划进行实验和制备供筛选化合物。（二）筛选和临床前研究阶段（三）临床试验研究阶段,（二）筛选和临床前研究

35、阶段,筛选：动物模型、体内实验临床前研究：实验研究阶段：生产用菌、毒种和细胞株的构建、培养和生物材料的选择，提取、纯化、理化特性研究小量试验阶段：制定给药方案、建立制备工艺及检定方法，小批量样品的临床前安全、有效性实验。中间试制阶段：生产工艺定型、产品质量标准制定、全面临床前研究（药理、毒理、“三致”性）、提供临床试验研究用量的连续三批产品。,（三）临床试验研究阶段,新药临床试验是指对其临床疗效和安全性做出评价，通过各期临床试验，对新药作出能否上市的结论。药物临床试验质量管理规范临床试验分四期。批准上市前，应当进行一、二、三期临床试验,1、一期临床：初步的临床药理学及人体安全性评价试验2、二期

36、临床：治疗作用初步评价阶段3、三期临床：质量作用确证阶段4、四期临床：新药上市后由申请人进行的应用研究阶段。考察在广泛使用条件下药物的疗效、不良反应等。,生物药物的新药申报,新药申请：是指未曾在中国境内上市销售的药品的注册申请。药品注册申请人向所在地省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门提出申请。新药注册申请应报送的资料：1、综述资料2、药学研究资料3、药理毒理研究资料4、临床试验资料5、其他,课堂练习,1、生化制药的生物材料来源有：动物脏器、血液及代谢物、海洋生物、植物、微生物2、生化药物干燥的方法有：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥3、常用的菌种选育方法有：自然选育、诱变育种、原生质体融合育种、杂交育种,4、发酵罐可采用的灭菌方法有：实罐灭菌、空罐灭菌5、培养基可采用的灭菌方法有：实罐灭菌、连续灭菌6、按照用途分类，培养基可分为：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基、补料培养基7、微生物的培养方式分为：固体培养法和液体培养法,本章小结,第一节 生化制药工艺技术基础生物材料和生化活性物质生化活性物质的提取生化活性物质的浓缩与干燥生化活性物质的分离与纯化第二节 微生物制药工艺技术基础微生物菌种的选育与菌种保藏微生物的培养发酵过程的控制第四节 生物制药中试放大工艺设计第五节 生物药物的研究和新药申报,