连续培养操作技术发酵工程课件.ppt

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1、连续培养操作技术,专题：,第一节 概 述一、基本概念,连续培养又称连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的发酵液总量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长的微生物培养方式。,分批培养：细胞是在封闭的系统中进行生长的。细胞的生长周期并不是微生物内在特性的表现，而是培养液中营养物受到一定限制的结果；细胞生长的中断是必需营养物消耗或有毒物质积累的结果。 连续培养：细胞是在开放系统中进行生长的。可在培养过程中移去部分培养液，同时以同样的速度加入新的培养基质，使整个系统中的微生物数量维持在连续的稳定生长状态。,与分批培养根本区别：,二、连续培养的特

2、点,1、就实用性而言：生产效率高、占地面积小、节省劳力、节约能量(如接种体的制备、反应器的清洗、灭菌)、产物质量一致、自动化程度高、可控性好，培养基制备技术和下游加工技术更为有效和经济。,2. 连续培养的最大特点是： 微生物细胞的生长速度和产物的代谢均处于一个恒定的状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。,在连续培养过程中微生物细胞所处的环境条件，如营养物质的浓度、产物浓度、pH以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节微生物细胞的生长速度。,3、作为一种研究工具：连续培养可以提供一种恒定的培养状态，在此状态下微生物的比生长速度恒定，细

3、胞的生理生化特性较为一致，是研究微生物生理学、遗传学及生态学的理想材料。 4、连续培养用于生产：有利于生产效率和控制技术自动化程度的提高。,5、工业化应用的主要障碍：（1）一些生产株系在连续培养过程中会由于筛选压力而产生一定的变异和变得不稳定。这是其工业化应用的主要障碍，对于基因修饰细胞尤为如此。 （2）另外，在大规模生产过程中，要在长时间内保持同样的培养环境是很难的。 （3）有时，细胞在反应器壁和传感器上的黏附会妨碍培养过程的长期运转。,三、连续培养的应用,1、在连续培养过程中可以独立地改变某一个生长参数，从而有利于在加工过程的优化中对细胞的生长和代谢动力学进行研究。 2、与分批培养方式相比

4、，连续性混合培养方式更易于进行多菌种间的竞争作用或相互作用方面的研究。,3、在连续培养过程中可以“捕捉”到一些在分批培养过程中很难观察到的现象，如：同步生长和振荡现象。 4、对连续培养在一个变量上浮或下滑过程中的过渡性质进行观察，是研究细胞生长和代谢规律的一种有效手段。这种过渡特性也可用于培养方式的设计与优化。 5、除此之外，连续培养还是筛选那些具有优良生物学特性和繁殖力的菌系的有效手段。,在20世纪70年代，连续培养的应用使生物学和细胞生理学方面的基础研究受益匪浅，并在80年代和90年代初期重新得到使用。 其主要原因是：连续培养在单细胞蛋白、乙醇、溶剂、食品的工业化生产及废水处理中具有巨大的

5、应用潜力。,目前，连续培养在生物技术中的应用多集中在废水处理、初级代谢物 (如乙醇、有机酸) 和发酵型食品的生产、酶的催化反应等方面。 另外，对动物细胞进行连续培养，可以进行单克隆抗体和重组蛋白质的生产。,原因：难以保证在长时间的连续培养过程中进行纯种培养，而且菌种在此培养条件下发生变异的可能性较大，在工业规模的生产上很少采用连续发酵。 目前，只有在丙酮丁醇厌氧发酵、纸浆液生产饲料酵母以及活性污泥处理各种废水等方面，才使用连续发酵工艺。,但是，工业规模的生产上很少采用连续发酵,连续培养技术的主要用途依然局限于实验室规模的基础研究和工艺优化。 例如： 1、利用连续培养技术可以对一些新型生物技术，

6、如通过基因修饰细胞对动物细胞和微生物培养进行定量研究。 2、连续培养技术还可用于生物反应器的定性、控制及放大试验等方面的研究。,新型恒化器(如自动恒化器)的开发与使用，不仅克服了恒化器的一些不足之处，而且开辟了连续培养的新途径。 随着高稳定性重组菌株和细胞系的出现以及高稳定性和准确性在线检测及控制技术的发展，作为研究工具，连续培养技术在基础研究和工业化生产中的应用将更为广泛。,发展潜力,四、连续培养的操作简介,根据控制模式，可分为两种类型。 、恒化器(Chemostat)系统：以恒定不变的速度加入某一必需的限制性营养物，从而使系统中的细胞密度与生长速度发生相应变化。 、恒浊器系统：在此系统的控

7、制过程中加入新鲜培养基,从而使系统中的细胞密度维持不变。 虽然控制菌体生长速度的方法并不一样，但他们是互相补充的，可用相同的动力学表达式来表示。,最简单的方法是在生化反应器内部的一定高度处安装一个溢流管，从而当一定的新基质进入反应器时，就会有等量的培养液进入溢流管，并在重力作用下通过收集器；也可使泵体与培养液出口相连,但必须要保证新基质的压入速度与流出速度相等。,这两种系统的基本要求是使生化反应器中的培养液体积保持不变。控制培养液体积的方法:,(一) 典型恒化装置：,包括：灭菌的培养基贮存器、加料和出料泵、附搅拌器的培养罐、流出液面指示器(以保持培养罐恒定的容积)、pH控制器及取样装置，对需氧

8、微生物还有通入无菌空气的装置。系统的pH、温度、溶解氧等控制恒定。 比较复杂的系统是把整个反应器放在一个天平或负荷单元上，通过控制培养液的出口速度来保证反应器的重量保持不变。,在实际操作过程中，除了对基质进入反应器的量进行控制以外，还需要考虑一些其他的环境参数，如温度、pH、溶解氧。,除恒化器之外，能够进行连续培养的设备还有：1、维持细胞密度恒定不变的恒浊器2、不改变剩余底物浓度的营养恒定反应器(nutri-stat)3、维持pH不变的pH自动恒化器(pH-auxostat)4、控制CO2排出速率(CER)为恒值的CER-恒化器(CER-stat)5、维持氧量不变的溶氧恒化器(DO2-stat

9、)和摄氧恒化器(OUR-stat)等。,其他连续培养设备,第二节 连续培养的控制技术一、连续培养的基本理论,连续培养的方式有：单级连续培养、细胞回流单级连续培养和多级连续培养。,根据控制参数和操作模式不同，可将连续培养分为4种类型：,这些培养方式的共同点是： 在培养过程中，新鲜的灭菌培养基以恒定的流速(F，单位为L/h)输入，与原有培养液瞬时混合后，以同等速度从培养罐流出，因而培养罐内液体体积(V ，单位为L)保持不变。 流速与液体体积之比定义为稀释速度(D)，即： D =F/V。,1、单级连续培养恒化器,整个培养过程是在一个培养罐中完成的连续装置称为单级连续培养装置。 细胞在恒化器中的生长速

10、度是由必需营养物的供应速度所决定的。这些营养物可以是碳、氮、磷或一些微量元素或维生素，而所有的其他必需营养物必须保持过量。 在此，以最常用的完全混合型单级连续培养恒化器为例介绍恒定状态理论及其特性。,(1) 菌体平衡,图6-2(a)是一个典型的单级恒化器示意。在恒化器连续培养的初始阶段，是一种分批培养。在一种营养物成为限制性因素之前，就要开始加入该营养物。直至所选择的营养物成为限制性因素时细胞才停止生长。在此之后，细胞的生长受制于培养基的添加速率。为了描述恒定状态下恒化器的特性，必须求出细胞和限制性营养物浓度与培养基流速(主要的独立操作变量)之间关系的方程。,利用物料平衡可以很容易地建立出有关

11、的方程。对发酵罐而言菌体平衡可表示为：,这些方程成立的前提条件是假设:、细胞在反应器中的分布是完全随机的，即细胞未产生相互粘连或黏附于反应器壁上，而且悬浮液混合充分;、细胞群体是不可分隔的，且其中细胞的生理学特性完全一致;、细胞群体浓度X是一个持续性变量，即细胞的数目足够大，单个细胞的尺寸小得足以使生物基质的不连续性可以忽略不计;、与培|养基的总体积相比，细胞所占据的体积可以忽略不计。,(2)、限制营养物的物料平衡,在连续培养的恒化器中，进料速度是外定的，细胞生长受制于所选择的营养物。也就是说,微生物的特定生长速率(,单位为h-1)是限制营养物一次函数。当连续培养同时受制于一种以上的营养物时，

12、该定义就会得到拓展。但是,加人长抑制性营养物或者能够产生毒素的营养物就会在所有营养物都保持充足的情况下抑制菌体的生长。严格来讲,这些都不能称为恒化器连续培养。,假设培养基一进入反应器中,就可以立即均匀地分布在整个培养基中,那么对于发酵罐,而言,限制营养物的物料平衡可表示为:,式(6-7)表示了连续培养细胞浓度与限制底物浓度的关系。这里有几个假设,即:假设细胞产率与比生长速度或稀释速度无关,细胞浓度除一种限制底物外与其他营养组分无关(它们都过量存在);其他环境因子都保持恒定。这些假设都近似或完全切合实际。,(3)、细胞浓度与稀释速度的关系,方程(68)和方程(69)分别表示了S和X对培养基流速(

13、也就是D)的依赖关系。当流速很低时,即D很小时,营养物全部被细胞利用,S0,细胞浓度X=S0/YX/S。如果D增加,开始X呈线性慢慢下降,然后,当D =Dc= max时,X下降到0。开始时S随D的增加而缓慢增加,当D = max时,S接近于S0。在方程(69)中,当X=0时,达到清洗点。,（4）实际操作与理想化单级恒化器连续培养动力学的偏离,上述简单的单级恒化器连续培养动力学在某些微生物中的适应性已得到证明，其中包括细菌、酵母菌以及植物细胞和动物细胞的培养。 大多数情况下，在这些培养过程中营养物质的进料速度很低、在小型生物反应器中进行、而且/或者其稀释速度的范围相对较窄。在这些条件及倍增时间(

14、td)的关系曲线下，在建立上述方程时所做的假设是成立的。,然而，偏离这种理论的现象也时常发生。 如图64所示，在连续培养过程中，由于稀释速度的变化而导致生物量的变化情况偏离单级恒化器动力学理论的典型曲线。 导致这种偏离的原因：可能是细胞与设备和反应器的流体力学作用，如细胞的贴壁生长和搅拌不充分。,贴壁生长是由细胞在玻璃或金属器皿的表面产生黏附所造成的。 如图6-4(a)所示，贴壁生长会增大稳定状态下的生物基质的浓度，从而导致操作过程中的稀释速度大于最大特定生长率。,贴壁生长的影响,Brown等人研究了不充分的搅拌(滞流区)对连续操作培养的影响图64(b)。 在一定的稀释速度范围内细胞浓度会显著

15、下降，其下降程度取决于滞流区的大小以及滞流区和充分搅拌区间的液体交换速度。,不充分的搅拌的影响,在简单的恒化器动力学中，人们假设培养基是搅拌充分的，即一滴培养基在进入反应器后应该能够立刻、均匀地分布在整个培养系统中。量化地讲，这就意味着搅拌所需时间小于物质传递和生物反应需时间。 在实验室规模的反应器中，所用的培养基只有几升，这时通过维持适当的搅拌速率就可以获得近乎充分的搅拌效果，除非反应器具有搅拌不到的区域或者培养基质变得很黏稠。 然而，在大型反应器中搅拌不完全的现象是不可避免的。,在实验室用反应器中连续培养动力学的偏离通常是由生物反应所致。 其他因素包括：由于溢出代谢现象和产物或底物对菌体生

16、长抑制作用的存在，维持需要量(维持菌时所需要的营养物量)和菌体生长量会产生变化；当菌体处于或低、或高的生长速率时都需要进行相应的调节和分离操作。,如图64c和图64d所示，维持代谢和生长受到抑制都会使稳定培养状态下的菌体浓度有所降低，当稀释速度较低时尤为如此。当菌体的生长受到强烈抑制时，只有当稀释速度明显低于max时，才能进行连续培养。 上述操作因子可能会同时存在于一个培养系统。在这种情况下，菌体浓度和稀释速度间的关系则变得更为复杂。,维持代谢和生长受到抑制的影响,（5）连续培养生产率与分批培养生产率的比较,目前在工业生产中连续培养主要用于生产微生物菌体。 以此为例，可比较一下连续培养的生产率

17、与分批培养的生产率。,连续培养的生产率可表示如下:,由式(6-16)可见，max越大，连续培养生产率与分批培养生产率之比越大，采用连续培养越有利，如max过小，则不宜采用连续培养。,2. 自动恒化器连续培养,在自动恒化器中可以通过调节培养基的输入速度来使菌体生长依赖性参数保持恒定，稀释速度和菌体的生长速度也得到相应调节。 对于自动恒化器而言，可选择性控制的反馈参数是相当广泛的，其中包括细胞浓度(浊度)、pH、溶解氧的浓度、气体流中的C02含量以及营养物和产物的浓度。 有些时候参照自动恒化器的控制方式，以营养物为反馈生长参数可以将营养恒定反应器改进为营养自动恒化器。在不同种类的自动恒化器中应用最

18、多的是恒浊器和pH自动恒化器。,恒浊器中的控制参数是菌体浓度。 由菌体浓度传感器产生的信号传给泵体，当菌体浓度高于所规定的水平时泵体自动加入培养基。这样通过恒浊器控制的反应器中的菌体浓度是一定的，稀释速度则自行调节至稳态值。 （而在恒化器中稀释速度是一定的，菌体浓度则自行调节至稳态值）。,恒浊器,从原则上来讲，恒浊器适用于菌体浓度随稀释速度改变(如接近于极限稀释速度)而产生明显变化的培养过程。 另外，恒浊器也可在有多余底物存在的一定情况下进行菌体培养。,既然菌体的生长速度并不是固定的，利用该培养系统就可以筛选出生长较快的微生物。 通过不同基因型微生物(突变体)的筛选和细胞代谢的调节可以增大菌体

19、的最大生长速度。,但是由于微生物在传感器表面的黏附，恒浊培养技术的应用仅局限于单细胞微生物，而且也难于进行长期和大规模培养。 随着以激光或近红外透射/散射为基础的光学传感器的发展，与菌体长期控制有关的问题可能会得到部分解决。,在pH自动恒化器中，结合使用了新鲜培养基的加入和pH的控制技术。 当pH偏离设定的pH时，就通过加入新鲜培养基的方式使pH回到设定值。 培养基的加入速度取决于培养基中营养物的缓冲能力的浓度。,H自动恒化器,在用新鲜培养基控制pH的过程中，通过调整进料的缓冲能力和（或）其中的限制营养物浓度，可以控制反应器中限制营养物的水平。 当培养系统的产酸量或产碱量比较高时，培养基的缓冲

20、能力可能达不到要求。在这种情况下可将营养物和培养基分别加入。 营养物的浓度决定了菌体在摄入营养物时产生和释放出的离子种类和数量。,菌体在pH自动恒化器中的特异性生长速率与培养基的缓冲力和培养基中营养物质的浓度呈反比。 简而言之，菌体在低缓冲力培养基中的生长速率是其在缓冲良好的培养基中的10倍以上。菌体浓度也主要取决于培养基的缓冲力。,培养系统中pH的变化是细胞生长情况及其代谢活力的良好指示。它是菌体在吸收营养物的过程中产生不同离子种类和所释放出的离子数目的一个综合表现。 导致培养系统中pH下降的原因：通常是有机酸的生成和铵的吸收。 然而对于在蛋白质或氨基酸富裕的培养基上生长的微生物而言，pH将

21、会随着菌体的生长而增大，因为菌体在此过程中产生了多余的氨。,一般而言，自动恒化器优于传统的恒化器。 首先，自动恒化器可以在接近最大生长速率的“高获取量(high gain)”范围内进行操作。 其次，在高的稀释速度下，自动恒化器达到稳定态的速度比开放循环式恒化器更快。 再次，在自动恒化器中菌群选择压力下可以加快培养的进程。 最后，自动恒化器可以设计成双点式(dual set-point)自动恒化器，可以同时控制两种生长参数(如两种营养物的浓度)。这种双点式自动恒化器可以很容易地控制营养物的浓度比例。 但从另一方面来讲，自动恒化器的试验计划和操作过程是比较复杂的。,3. 细胞再循环单级恒化器,细胞

22、循环是在连续培养过程中提高菌体和产物浓度的一种有效途径。在此系统的操作过程中稀释速度高于菌体的最大生长速度，从而导致较高的反应器产出量。这种反应器的另一特点是，稀释速率几乎与菌体的生长速率无关。由于菌体再循环操作增大了稀释速率的临界值，从而可以防止底物抑制作用所带来的菌体生长休克现象。 特别是它具有以下优点：、在流出物的处理过程中生长限制营养物不可避免地得到稀释；、当所用的底物为气体时，底物的溶解性低；、因为仰制性产物的形成，生长限制底物的浓度必须处于有限水平；、产物的形成与菌体的生长无关。,用于回收菌体的方法很多，如过滤、沉淀、离心和固定化。 根据反应器内部或外部的分离设施，可将这些方法进一

23、步分为内部系统和外部系统。 除废水的生物处理以外，最常用的一种方法是，在反应器外部用膜过滤的方法对培养物进行浓缩。 废水的生物处理中长期使用的一种方法是，对污泥进行沉淀后再进行循环处理。,图62(c)所示，单级恒化器的流出液经过滤、沉淀、离心或固定化后，再将得到的微生物细胞部分地回加到发酵罐内，形成再循环系统。这样可以增加系统的稳定性，而且可以增加恒化器内的细胞浓度。 X1、 X2分别代表从发酵罐和离心机流出的细胞浓度，F和F1分别代表流入发酵罐的培养基流速和流出离心机的培养液流速。如果引入再循环比率和浓缩因子C两个参数，再采取与前述类似方法可推导出，在恒定状态下:,动力学：,由此可见，当存在

24、细胞再循环时不再等于D0，因为C 1，所以1+一C永远小于1，则永远小于D。这就表明，在带有细胞再循环的单级恒化器中，有可能达到很高的稀释速度，而细胞没有被“清洗”的危险。同样，恒定状态下的细胞浓度比不具有再循环功能的恒化器中的细胞浓度高出一个因子1/(1+一C)。,4. 多级连续培养,图6-2(d)为一种简单的多级连续培养：,由表6-2可见，在第2个发酵罐内 2D2，如果不向第2个发酵罐补加新鲜培养基，则第2个发酵罐内的净生长速度就会很小；如果向第2个发酵罐内补加新鲜培养基，不仅可以促进细胞的生长，而且可以使D处于比 max更大的数值。,二、实验设计与操作1. 实验的设计与操作原则,在设计一

25、个长期运转的连续培养系统时，必须要注意到，由于选择压力的存在有可能使菌体产生自发性突变。具有竞争优势的菌体迟早会战胜反应器中的原始菌株。因此在研究均一细胞群体生理特性的过程中，为了研究细胞对环境条件变化的反应和由于突变所导致的基因变化，一次培养的时间不应过长。,（1）实验的设计,在培养时间过长(例如：对于肠杆菌来讲，大约为23周)时，一些培养物会在代谢压力(例如：底物过量、生长因子的限制、产物抑制等)下产生聚集或产生强烈的贴壁生长。 当对在这种情况下获得的数据进行分析时应该加以注意。对于这些类型的培养来讲，也应对操作时间进行限制。 如果计划进行长时期操作，应该考虑到，对管道(由于泵送和酸、碱溶

26、液的作用产生破坏)和加工中所用到的气体输入和流出管道进行必要的替换。,对培养基进行设计的基础是，用于细胞生长和产物合成所需要的营养物质，除了含有平衡生长所必需的所有组分或那些有可能对菌体的生长动力学和产物形成产生干扰的营养物质以外，还应在连续培养中建立起营养物质的适当浓度。特别是，要对某种生长因子进行限制时更要如此。随着新型生物技术(如重组DNA)在高价值产物的生产过程中变得越来越重要，化学合成培养和适应进料方式的应用也越来越广泛。对于这些目的来讲化学计量学和代谢调控的思路是特别重要的。,（2）培养基的配制,为了避免沉淀物的产生，应该考虑到培养基的稳定性和营养物质间的相互作用。培养基中组分产生

27、沉淀的原因可能是，高浓度的金属离子(如铁、钙、镁等离子)、高压灭菌过程中的高温以及高pH。这会导致金属离子和一些其他痕量元素的损失以及对细胞的生长和产物的形成产生不良影响。为了获得较高的细胞浓度，应该对金属离子和痕量元素进行仔细控制(或减少)。EDTA和柠檬酸之类鳌合剂的使用，特别是与其他方法结合使用，可以有效地减少沉淀的产生。正确地选择金属离子也是很重要的，因为那些与磷酸盐和镁离子相关的不溶性盐的形成通常也会带来一定的问题。,连续培养系统的灭菌比分批培养系统更为复杂，因为它需要更多和更大的贮液槽来贮存喂料培养基和酸、碱溶液，而且在操作过程中需要对其进行重新填充和替换(图65)。,（3）培养基

28、和设备的灭菌,培养基中的一些组分或酸、碱溶液需要进行灭菌。 与各种贮液槽连接的输送管道和与反应器连接的肉汤容器会成为污染源，因此应该对其进行灭菌处理，并进行仔细连接。应在无菌环境下进行连接操作，例如，如果反应器系统较小，则要在干净的操作台上进行连接。 当反应器的体积大于5L时需要进行原位灭菌。可以用121的湿蒸汽进行原位灭菌。可将蒸汽通过双层或反应器内部的热交换器对设备进行间接灭菌,也可将蒸汽直接通人反应器中进行直接灭菌。直接通入蒸汽是比较快速和容易的操作方法，但是，由于蒸汽的冷凝作用会使培养基的体积增大10%15%。,大型反应器的管道系统一般用蒸汽进行原位灭菌。管道系统应该尽量地短、直,并呈

29、一定坡度向下走向,从而保证蒸汽及冷凝蒸汽在重力的作用下顺利流出。应该尽量避免T形连接。 为了将污染减少到最低程度,所有与反应器的无菌操作部分连接的管道都应该进行焊接处理,而不应有可以拆卸的连接部分。这是非常昂贵的,因此只用于特殊的加工过程(如细胞培养)。 在生物反应器的实际操作中需要用可以拆卸的连接方式，从而使反应器具有较高的灵活性。在这种情况下与灭菌设备相适应,所有的连接部分都应设计成凸缘形。为了避免尘土的积累,凸缘连接点处的管道交叉部分既不能减少也不能增加。最普遍的两种凸缘系统是所谓的快速连接夹环系统和螺丝系统。这些凸缘连接的共同特点是,通过O形环可以达到无菌连接。O形环是自动密封元件,其

30、所用的全部密封压力随着系统压力的增大而增大。,连续培养过程中,温度、pH和溶解氧（PO2)的测定和控制方法与分批培养相似。然而,在连续培养过程中,pH和PO2有些在短期发酵过程是不常遇到的问题。由于生物膜的生长及蛋白质和其他物质在探测器顶部的吸附,会引起pH和PO2探测结果产生一定的偏移。然而可以通过改变培养系统的pH,并与非在线检测的测定结果进行对比,就可以对pH探针进行粗略校对。但是溶氧探针则不能进行如此校对。在任何时候只要可能,就应该用极谱仪溶氧探针。在自动清洗以后它比电流溶氧探针更为稳定,可用零点电极对其零点进行校对。.,（4）环境的控制,微生物的连续培养是以分批培养的方式开始的。在底

31、物彻底消耗完之前,这种培养系统一般会在菌体指数生长期转换为连续培养。在系统发生转换以后培养系统的转运动力学特性会发生很大变化,其变化情况取决于转换发生时的培养特性及反应器的环境。环境因素的突然变动,特别是当底物由限制水平转变为过剩水平时,就会产生振荡性转换。如果培养系统中突然进入一种浓度非常高的有毒性底物,就会产生非常强烈的振荡性转换,以至于要将菌体全部洗出。如果系统表现出特别的复杂,连接培养启动的时间和操作模式会导致不同的转换特性和不同的稳定状态。,（5）操作系统的启动,在大多数情况下,在起始的分批生长阶段只用一半浓度的培养基就可以使分批培养平缓地进入连续培养阶段。当细胞浓度达到稳态培养中细

32、胞浓度的一半时开始补入营养料。通过这种方式,在转换发生以后培养系统开始进入一种营养物限制性供给的分批培养阶段。随着细胞浓度的增大,细胞的生长速度不断下降,直至达到稳定状态时的细胞浓度。此时,开启液面控制器,开始进行连续发酵。,稳定状态的定义为,细胞生理机能上的加工参数(如底物浓度、菌体、产物)不再发生变化时的连接培养条件。通常情况下,只通过在线或非在线地检测加工参数的水平来判断培养系统是否达到稳定状态。在这种情况下可能会涉及到许多参数。如果有产物形成,应对产物的浓度给予特别重视。通常情况下产物到达恒值的时间晚于菌体和底物浓度。甚至细胞生理机能到达稳定状态的速度更慢,当其需要进行长期适应时尤其如

33、此。 在由Monod动力学控制的理想恒化器中,达到稳定状态所需要的时间大约为, 在条件发生变化以后进行34次培养转换所用的时间。培养的替换时间(剩余时间)表示为1/D。实际上,达到稳定状态所需要的时间一般更长,其具体的时间取决于培养系统的动力学特性和变化的大小。,（6）稳定状态下的动力学特性和检测,图66给出了一些例子,它们说明了当培养基的进料速度一定时连续培养在底物浓度发生不同变化以后的转换特性。当新的料液浓度(y0)刚好处于前面稳定状态值(y01)之上时,大约在停留40次时间以后才重新达到稳定状态。停留24次以后,才能看出其中的变化。,在一些培养系统中会发生多重稳定状态。根据操作模式,在相

34、同的培养条件下可以得出两种显著不同的稳定状态。近年来,人们对连续培养中微生物的多重性和稳定性进行了理论分析和数学分析,并将其与实验结果进行对比。图67描述了在一定的底物浓度下进行培养的一些结果。就目前的实验结果来看,对于在没有底物限制条件下生长的微生物来讲,在底物过量的情况下,产物抑制作用和产物形成速度增大的结合作用成为形成多重性和滞后现象的主要原因。这些因素的综合影响也能导致不正常的动力学特性,即产生振荡性转换,由一个稳定态转向另一个稳定态,并且继续产生振荡性转换。,第三节 连续培养的附属设备,一、连续培养的一般设备,在连续反应系统中至少含有3个这样的单元。(1) 反应容器: 即在生物反应器

35、。处于中心位置，其上装有用于输送气体、搅拌液体(培养基)和固体(细胞或不溶性物质)的装置，取样孔以及温度、pH、溶解氧、泡沫和反应体积的控制设备。,(2) 适于灭菌的培养基贮存器、pH和泡沫控制液贮存器 一般而言，其中贮存的应为均质的混合培养基，其中含有碳源物质和能源物质(如葡萄糖)以及一定浓度的其他营养物。 如果所用的组分为对热比较敏感，所需容器还要更多，因为它们需要单独灭菌。可以在进入反应器以前，用具计量功能的仪器(如泵)将组分混合在一起，或者将各组分用不同的输送管道分别连接在反应器上。,(3) 肉汤的取出和连接容器 虽然不是必需的，但其在培养基流速的检测方面是十分有用的，而且还可以避免微

36、生物流失到环境中。 此装置与满足一些用途如菌系(或突变体)筛选的连续培养配置相比要简单得多。,二、设备的选择与设计,发酵类型决定了设备的选择。 培养基的组成(化学的或复合的)和微生物形态(丝状的或单细胞的)严格地决定了所用的设备类型。 因此，以下建议只能作为指导，在实际应用过程中还应根据实际需要对其进行改进或替换。,1. 反应器.,反应器的规模是在连续培养中进行设备选择和制订培养计划时所要考虑的重要因素。反应器的工作体积在很大程度上决定了培养基的消耗量和其他附属设备。 用于研究目的的小试反应器操作起来比较方便，所需资金和空间适中，所用蠕动泵的可信度高。而且这种反应器易于进行拆分清洗。,然而，小

37、型容器具有一些独特的问题：当培养基的体积少于500ml时，取样会导致培养液体积的显著减少，从而对稀释速度产生影响并导致培养系统产生振荡。在低稀释速度水平上，很难对流速进行控制，而且进料流速较低时混合培养基中的物质会在输送线中产生沉淀，从而产生堵塞现象。在较低的压力和通气速度下，通常很难对气体进行在线检测。当培养容器小时贴壁生长菌体在全部菌群中所占的比例会变得相当大。,在大多数情况下，工作体积为15L (整体体积为27L)的微型培养系统是比较合适的。 动物细胞培养用反应器理想的工作体职较小(如0.52L),因为所用的培养基比较昂贵。 另外，在选择反应器时还应考虑到其在分批培养或补料分批培养中的应

38、用。 虽然也有其他类型的小型反应器，如气升式反应器和流化床反应器，但是在小试培养系统中常用的仍然是搅拌釜反应器。,对于反应器类型的选择在很大程度上取决于研究目的。 小型搅拌釜反应器还包括各种不同的设计，例如：容器的底部可以设计成平底或圆底的。 平底反应器易于台式操作和自动清洗。 圆底反应器的搅拌性能较好，多用于剪切力敏感细胞的培养。 还有夹套式的反应器，玻璃夹套式反应器比热交换器内置式反应器的控温效果要好，夹套式反应器更适用于热敏性培养系统。,2. 营养物贮液槽及其附件,营养物贮液槽应具有输料孔、热敏性营养物、底物添加孔和/或搅拌孔、通风孔及营养物排泄孔。 进料孔和排料孔应该通过不锈钢管道与容

39、器的底部相连。通风孔与无菌过滤器相连。 贮液槽中必需有一个磁力搅拌棒，以便使所有的颗粒都能悬浮起来，并对后来加入的灭菌培养基进行搅拌。 专用的取样孔可用于从贮液槽中取样，以便测定再次注满的贮液槽中底物的准确浓度。,可用(外有木箱保护的)小口大玻璃瓶或玻璃烧瓶作为中转贮液槽，瓶的容量应足够大，其中所装的培养基应至少能够满足一次稳态培养的要求。 中转贮液槽中培养基的量可用体积表示，可将贮液槽放在一个称重器上，以便在几个小时或几天后检查营养物的进料速度。另外，它还应具有足够的灵活性，以便在菌体生长限制物不同时进行营养物浓度的调整。,中转贮液槽,系统中所用的管道应为硅胶管或特殊的不透气性管道。这种管道

40、应能够耐受重复灭菌, 并能保持其原有的弹力，且具有良好的化学稳定性。 在进行管道的连接时应做到无菌、快速、可靠。 应意识到，蠕动泵的流速取决于管道的弹性。因为随着使用时间的延长，硅胶管会失去其原有的弹性，所用的管道应该有足够的长度，以便每隔一天就剪掉一段，使泵与新的管道部分相连。在必要时对管道进行更换,以便进行连续操作。,管道及其连接,培养基输入口可与离反应器很近的一个滴管相连。滴管在培养基的流动途径中起到一种缓冲作用，并且能够防止微生物感染料液输送管道。 这种滴管可从发酵罐生产厂家购买或自行设计，如图69所示。如果反应器中的压力增大,滴管的缓冲作用就会失灵。,3.液体培养基的排出及其水平的控

41、制,为了准确和持续的控制稀释速度，必须测定和控制培养系统的工作体积。 培养系统的工作体积通常定义为：未通气的液体体积。,用于控制未通气的液体体积的参数有两个： 1、通气后的液体体积(假设液体的持气量为常数) 2、反应器内容物的重量。 由于通气后的体积易于控制，其应用范围较为广泛。如果换为重量控制，则只要安装正确就能进行准确控制，但是对于分批培养来讲，这种控制方式的成本太高。在图65所示的反应系统中，工作体积的控制为重量控制单元。根据天平上的信号来控制泵体除去培养基。,用于控制通气后液面的基本途径有两种。 1、最简单的一种是通过由通气产生的压力控制。 气流的排出设备可置于液体培养基的表面。气流直

42、接通入一个废物贮液槽中，后者由无菌空气通气并通过空气灭菌设备与大气相连。当培养基的体积增大至高于气体流出孔时，液体培养基被压进一个含气的贮液槽中。有时，可用泵体抽出液体培养基,而不是用气流。 这两种系统都存在一个问题，即处于气/液界面的细胞浓度与其在整体液体的浓度大不相同，当有泡沫形成时更是如此。这就会导致由反应器中取出的培养基不具有代表性。,2. 另一种方法是用液面控制器进行控制。 虽然这一技术所需要的设备较多，但用它可以从液体表面的下部取出肉汤。 目前已有一定数量的液面控制器面世。其中大多数控制器的基础是容器内部与液体培养基进行物理性接触的传感器。由于传感器位于反应器的内部，一旦探测失灵，

43、就不能再用。所用传感器的类型不同，导致体积控制有所偏差的原因有由搅动、通气、泡沫的产生以及贴壁生长等现象所造成的振荡。 除此之外，还有超声波水平控制器。它可以连接在玻璃或不锈钢容器的外侧。如果传感器发生故障,可以在对无菌操作状态不产生任何影响的情况下对其进行替换。,4.气体的输入与输出系统,图610所示为气体供给与流出系统的一个例子。 气体的湿度阻止了容器中培养基水分的蒸发，如果在气体输出管中对培养基的流速进行测定，还可以提高判断稀释速度的准确程度。当操作温度相对较高(如高于35)时，当所用的压缩气体很干燥时，或者当稀释速度小于0.1h-1时，这一点就显得非常重要。 可以用适当孔径的膜过滤器或

44、包装好的玻璃纤维过滤器对气体输入系统进行灭菌。 用由T字形物连接起来的两个过滤器进行预处理，当用到加湿器时更要进行如此处理。当一个过滤器产生堵塞时,可以松开另一个过滤器的夹子,马上投入使用。,为了安全起见，对气体供入量进行调节是非常重要的。当气体输出管发生堵塞时气压应当低得足以防止容器产生爆炸。 流出的气体应直接进入一个溢流贮液槽(安全容器)中。通过这种方式可以控制泡沫溢出现象。然后溢流贮液槽与装有0.5%漂白剂的刻度圆筒相连。 如果要对气体进行在线检测，就需要从贮液槽中引出一个气体支路。,剩余的排出气体引入圆柱体液体中，然后由灭菌过的过滤器中排出。 这个圆柱体有多种功能。 首先，它为容器提供

45、了一定的回压，这种压力是对流出气体进行分析时所需要的，也有利于取样。 其次，它是目测气体流速是否达到足以进行气体分析或反应系统是否密封完好的一种手段。没有气泡产生时，表明系统失去控制。当培养的菌体为致病性微生物或重组微生物时，特别要考虑这一点。 最后，它可以作为一种清除器，以减少实验室中的不良气味。,5. 细胞再循环装置,在实验室规模上，通过使用可进行蒸汽灭菌的微滤膜组件，可以很容易对细胞进行再循环处理。 图611所示为这种组件的一个简化结构。它由毛细管状微孔膜组成。 膜通常由聚丙烯或与其相似的材料制成，而且最初是疏水性的。当用乙醇进行湿润以后变成亲水性的。通过改变膜组件的直径和孔径，可以获得

46、不同的过滤面积。,微滤过程中常见的一个问题是，在操作过程中过滤速度会有所降低。这主要是因为在膜表面形成了生物膜和蛋白质膜(膜污染)，和膜亲水性能的丧失。影响膜污染的因素包括细胞的浓度与特性、循环速度以及液体培养基的特性和过滤速度。消泡剂的使用也会对膜的操作特性产生显著影响。为了减小膜的浸染程度，通常用齿轮泵来使液体培养基的循环速度最低维持在0.51mA。当所培养的菌体为剪切力敏感性细胞时，这种操作就会带来一定的损伤。,应该定期用渗透液对膜组件进行反冲。 这种反冲操作的示意如图所示。进行冲洗时可用小型渗透液贮备槽。这一操作过程可由计算机或计时器进行控制。当进行反冲时，打开气体(N2)输送管道，关

47、闭渗透液管道和泵体。渗透液通过反冲管路被压回膜组件。反冲压力(如105Pa)不应超过生产厂家所提供的膜组件的最大操作压力(对于大多数膜组件来讲，大约为2105Pa到3105pa。,对于长期运转的系统来讲，应该每天用无菌蒸馏水对膜组件进行反冲洗。在此之前，用NaOH溶液进行清洗或用乙醇进行湿润可以从本质上恢复膜组件的过滤性能。操作时应该注意防止NaOH和/或乙醇流入反应器中。 建议用两个平行的膜组件，当一个膜组件正在清洗时,可用另一个膜组件进行操作。,第四节 连续培养的应用,早在20世纪20年代，连续培养已被用于生产饲料酵母，但直到1950年，Monod等才对连续培养的理论加以分析讨论。 连续培

48、养在工业生产上的应用虽不如分批培养普遍，但在科学研究中日益得到广泛的应用。 本节拟对连续培养的应用情况进行简要介绍和举例说明。,一、概述,如前所述，连续培养的细胞生产速率高于分批培养，因此连续培养在单细胞蛋白的生产和丙酮、丁醇、啤酒等生产中得到了广泛应用。在废水的生化处理中采取对活性污泥进行循环利用的连续培养方式，有利于增加设备的处理能力和提高水的处理质量。,但是连续培养在工业上的应用远不如分批培养那样普遍。 这主要是因为连续培养的时间长、容易染菌及菌种易发生退化。当退化细胞所占的比例逐渐增大时,生产能力就会逐渐下降。另外,细胞在反应器、搅拌轴、排液管中的生长也增大了长期进行连续培养的难度。,

49、连续培养的特性决定了其在实验室具有广泛的用途,可分为以下几个方面。,1. 菌体生产,和分批培养相比，连续培养省去了反复的放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，因而设备的利用率高，菌体的生产率相应提高。,另外，在连续培养时选用适当的营养物质作为限制性基质，也有可能提高产物的生产率。举例： 利用连续培养变异链球菌生产乳酸时，利用碳源作为限制性基质时乳酸产量较低，但当用磷酸盐或氮源作为限制性基质时，菌体的生长受到限制，培养基中碳源转化为乳酸的效率提高，生产速率也大有提高。,有时可采用多级连续培养提高生产速率。例如： PHB的生产中，整个发酵过程可分为两个阶段来进行，即菌体生长阶段和PHB合成阶

50、段。 根据这一特点，考虑采用二级连续培养，第一级以碳源为生长限制性基质和氮源丰富的条件下，菌体细胞大量繁殖而胞内积累的PHB量很少，以获得大量菌体，第二级只流加PHB合成所需的碳源，而不补加氮源，促进PHB的生产。,2. 代谢产物生产,连续培养在工业上用于大量生产微生物代谢产物的实例较少，原因： 1、主要原因：长期运行时易发生杂菌污染和菌种退化。 2、菌体在反应器壁、搅拌轴、排液管等处生长，增加了实施连续培养的困难。 3、菌体在连续培养时不断被稀释，菌体浓度比分批培养时低，虽然连续培养在一些操作条件下有非常高的产物比生产速率，但胞外产物的浓度往往比分批培养低得多，这也是其应用受到限制的一个重要