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1、授 课 内 容,第四章 微生物的生长和生长发育的控制第三节 微生物的纯培养技术和菌种保藏技术,第五章 微生物的生长和生长发育的控制,第一节 微生物的生长第二节 影响微生物生长的主要因素第三节 微生物的纯培养技术和菌种保藏技术,第三节 微生物的纯培养技术和菌种保藏技术,一、无菌室和超净工作台 二、消毒与灭菌 三、实验室用培养基的制备 四、微生物的接种 五、微生物的培养 六、微生物菌种的分离纯化 补充：微生物的稀释平板混匀分离 七、微生物的菌种保藏,七、微生物菌种保藏,微生物的生长需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而
2、得以延续。,七、微生物菌种保藏,（一）菌种保藏的目的和意义（二）菌种保藏原理（三）菌种保藏的方法（四）菌种的衰退与复壮,（一）菌种保藏的目的和意义,菌种保藏的目的： 防止优良性状菌种的退化或变异。 注意：在实际工作中菌种的退化或变异是难以避免的。微生物的遗传与变异是正常的生物进化规律，变异是绝对的，稳定性是相对的。,（一）菌种保藏的目的和意义,菌种保藏的意义： 微生物菌种是珍贵的自然资源，通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。因此，菌种或培养物
3、保藏是一项最重要的微生物学基础工作，具有重要意义。,（二）菌种保藏原理,菌种保藏的方法很多，但原理大同小异： 首先要挑选优良纯种，利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥、缺氧、避光、缺乏营养等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。 即在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。,（三）菌种保藏的方法,基本方法,生活态,培养基传代培养,寄主传代培养,斜面、平板,液氮低温冰箱,沙土管,冷冻,干燥,休眠态,冷冻真空干燥,（三）菌种保藏的方法,主要介绍：1、斜面低温保藏法2、
4、冷冻干燥保藏法,（三）菌种保藏的方法,1、斜面低温保藏法 将生长旺盛无污染的斜面试管放入冰箱内，在46的低温下保藏，以后每隔23个月移接于新鲜的斜面培养基上，培养后再继续保藏（以补充菌株的养分和水分，防止菌株老化）。,（三）菌种保藏的方法,1、斜面低温保藏法优点：最基本、最简单的保藏方法，适用范围广，细菌和真菌都可适用。缺点：传代次数多了容易发生变异，如产生孢子能力下降、发酵能力减弱、毒性降低甚至基因失落等，传代次数多也容易使污染机会增加。方法的改进：（1）采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的棉塞或目前使用的硅胶塞； （2）减少培养基中碳水化合物的含量的方法。,（三）菌种保藏的方法,2、冷冻
5、干燥保藏法 将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。,（三）菌种保藏的方法,2、冷冻干燥保藏法优点：这种方法保藏菌种已有几十年的历史，由于它具有保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围较广等优点，是各保藏机构使用的主要方法（仅有一些不产孢子的丝状真菌不宜用此法），一般可保存数年至十余年。缺点：采用小箱式或多孔道的冷冻干燥机，设备和操作都比较复杂。注意事项：冷冻干燥时的介质对细胞的损伤有显著的影响，例如，大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷冻干燥法保藏菌种时，一般
6、应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。,冷冻干燥保藏法的操作流程,培养物的冻干过程,冻干菌种的保藏与再生,保藏冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培养物的长期稳定更好。,冻干菌种的保藏与再生,复苏(1)在超净工作台中用75酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。(3)在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。,（四） 菌种的衰退与复壮,在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对
7、的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。注意：在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。 相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退。,（四） 菌种的衰退与复壮,1、菌种衰退的表现2、菌种衰退的实质3、菌种的复壮,（四） 菌种的衰退与复壮,1、菌种衰退的表现（1）生长速度缓慢，产孢子越来越少。（2）代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。（3）其他原有的典型性状变得不典型，如：最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。（4）
8、对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。（5）抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。,（四） 菌种的衰退与复壮,2、菌种衰退的实质 菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变过程。注意：开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。,（四） 菌种的衰退与复壮,3、菌种的复壮（1）消极的措施：在菌种已发生衰退的情况下，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施。（2）积极的措施：在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地利用微生物会发生自发突变的特性， 在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作。,（四） 菌种的衰退与复壮,3、菌种的复壮问题： 利用所学的知识，如何进行菌种复壮？答：（1）纯种分离的方法； （2）测定生产性能方法； 等等。,国际重要菌种保藏机构,国内重要菌种保藏机构,
