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1、干细胞培养,2022/12/2,细胞培养：,概念：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体取出的细胞，并使之生存和生长的技术称为细胞培养,2022/12/2,体外细胞培养的条件：,体外细胞培养必须注意三个环节：营养、生存环境和废物的排除。体外培养细胞所需的营养是由培养基提供的。体外培养必须模拟体内细胞生长的环境。环境因素主要是指无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境。,2022/12/2,概述：,干细胞是一种自我更新、高度增殖以及多种分化潜能的未分化细胞。各种功能细胞的生成及其调控依赖于各种微环境、细胞生长因子、基质细胞、细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡，并涉及有关细胞增殖、分化、迁移、
2、定居、衰老、凋亡、癌变等许多生命科学中的基本机制。,2022/12/2,来源：,干细胞有多种来源，根据其来源的种属可以分为人干细胞、小鼠干细胞、牛干细胞、猪干细胞、大鼠干细胞等；根据其来源的部位可以分为胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓基质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、生殖干细胞、胰腺干细胞等。,2022/12/2,分类：,干细胞有两种分类：一是根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能或单能干细胞。,2022/12/2,特点：,干细胞
3、本身不是终末分化细胞（即干细胞不是处于分化途径的终端）；干细胞能无限增殖分裂；干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；干细胞分裂产生的子细胞只能在两种途径中选择其一或保持亲代特征，仍作为干细胞，或不可逆的向终末分化。,2022/12/2,胚胎干细胞：ES细胞,胚胎干细胞是一种经人工操作能够发育成一个新个体的全能性二倍体细胞。它是从早期胚胎内细胞团或原始胚胎生殖细胞经体外分化抑制培养分离克隆的，二者的形态、标志、体内分化潜能及种系传递功能都相似。,2022/12/2,ES细胞主要特性：,1、ES细胞在不同条件下具有不同的功能状态，它是饲养层细胞以来的。在有抑制因子存在的条件培养基中，
4、它呈未分化状态生长；在无抑制因子存在的培养基中，分化成各种细胞；在悬浮培养时，可形成胚状体。2、ES细胞具有分化成各种类型细胞的多潜能性，此种特性既可以在体内发育，也可在体外诱导。,2022/12/2,小鼠胚胎干细胞的体外培养：,概述：小鼠胚胎生殖细胞是生殖嵴的原生殖细胞，被认为具有胚胎干细胞的自我更新能力和多能分化能力，因此可以被视为胚胎性干细胞。,2022/12/2,用品：,培养基试剂和用品：胎牛血清、新生牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、bFGF（促有丝分裂因子）、Percoll细胞分离液、丝裂霉素C、NBT/BCIP试剂盒、胰蛋白酶、细胞培养用品和设备、玻璃吸管，显微外科手术器械、倒置显
5、微镜、解剖显微镜、普通离心机等。实验动物：昆明小白鼠，810周龄，体重3035g。,2022/12/2,步骤：,获取胎鼠成纤维细胞（MEFs）:将雌鼠与雄鼠合笼，次日见阴拴者记为0.5d，取1014d的胎鼠，去除胎胚头和内脏，无菌PBS漂洗两遍，用眼科剪充分剪碎，转移到50ml的离心管中，加入2030ml细胞消化液（PBS液，含0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA）37轻轻震荡消化约30min，过200目细胞筛，PBS离心漂洗2次，重悬细胞并接种，按普通方法传代，冻存，备用。换液时收集细胞上清液，4000r/min离心15min，过滤后使用。,2022/12/2,MEF饲养层的制备：取80%
6、融合的MEFs，加入10ug/ml丝裂霉素C，在CO2孵箱中孵育2H，加入细胞消化液，再用饲养层细胞培养液中和并吹打成单细胞悬液，调整细胞密度到4x105个/ml，在六孔板中每孔加入3ml，置CO2孵箱中待用。,2022/12/2,获取胚胎生殖细胞：取10d的胎鼠，在解剖显微镜下借助显微外科器械，于其腰骶部寻找并分离生殖嵴，再转移到胰酶中，用细口径吸管吹打，把生殖嵴消化成单细胞悬液，以0.5个胚胎/孔转移到饲养层细胞上，加入胚胎干细胞培养液（a-MEM，10%胎牛血清，1mmol/L丙酮酸钠，2mmol/L非必需氨基酸，2mmol/L左旋谷氨酰胺，100U/mL，bFGF）置于CO2孵箱中。,
7、2022/12/2,胚胎生殖细胞的常规培养：每日更换培养基，接种0d左右，选择鸟巢状并分化明显的细胞集落，按照常规手工挑克隆的方法选择并传代，或者使用Percoll液配制成细胞分离液，常规消化后进行梯度离心，选择含原生殖细胞最多的部分再进行分离，最后接种在新的饲养层细胞上。,2022/12/2,ES细胞的分化抑制培养：,在ES细胞的培养过程中，一方面要给以足够的营养物质以满足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基础培养基来解决，后者则由分化抑制物来完成。,2022/12/2,分化抑制物的选择：,目前有三种分化抑制物比较常用：饲养层（feeder layer）条件培养基（conditi
8、oned medium，CM）白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）,2022/12/2,成体干细胞：,成体干细胞包括：造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、肌干细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞和视网膜干细胞等。,2022/12/2,神经干细胞的培养：,用品：条件培养基：DMEM/F12=1:1、20ng/mLbFGF（促有丝分裂因子）、100ug/mL胰岛素。0.25%胰蛋白酶。D-Hanks液：NaCl8g、KCl0.4g、NaHPO4H2O0.06g、KH2PO40.35g、酚磺酞0.02g，加水1000mL溶解，调PH值为7.27.4，高压灭菌
9、，4储存。手术刀、弯钳、眼科剪、1mL注射器、手术弯盘、青霉素小瓶、细胞计数板。,2022/12/2,步骤：,取2周龄Wistar孕鼠1只，处死，70%乙醇消毒5min，剪开腹部皮肤打开腹腔，切取子宫，转入无菌90mm培养皿中。眼科剪从子宫处取出胎鼠，D-Hanks液冲洗，置冰台上，用眼科剪剪开头骨，小心将脑组织移入另一无菌90mm培养皿中，D-Hanks液冲洗。,2022/12/2,去除脑膜及血管，用手术刀反复切割脑组织，过200目筛，制成单细胞悬液。细胞计数，以106个/mL细胞密度接种于塑料培养瓶中，加入条件培养基，37、5%CO2饱和湿度恒温箱中培养。,2022/12/2,传代培养:,神经干细胞的生长特点是悬浮生长，增殖力强，67d传一代。一般一瓶细胞传成3瓶培养。传代的操作细节及注意事项与悬浮细胞的传代相同。神经干细胞的冻存与和复苏与正常细胞的操作流程相同。,
