植物组织培养第2章培养基及其配制课件.ppt

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1、第二章 培养基及其配制,目的要求：1、了解几种常用培养基的特点；2、掌握培养基的主要成分及其作用；3、掌握培养基的配制方法。,培养基(culture medium) ：,-是植物组织培养的重要基质。(土壤+自养条件） -不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。 因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,一、培养基的种类,最早的培养基:是Sacks(1680)和Knop(1681)，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养

2、，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液.,常用的培养基及特点如下：(1) MS培养基 1962年，Murashige和Skoog，培养烟草细胞。特点：无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液；硝酸盐含量较其他培养基为高；应用广泛基本培养基 。(2) B5培养基 1968年，Gamborg等，培养大豆根细胞。特点：含有较低的铵，对有些植物的生长有抑制作用；适宜于双子叶植物特别是木本植物。(3) White培养基 1943年，White，培养番茄根尖。特点：无机盐数量较低，适于生根培养。 （4）N6培养基 1974年，朱至清等，水稻等禾谷类作物花药培养。 特点：成分较简单，KNO3和（N

3、H4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。(5) KM8P培养基 1974年，原生质体培养。特点：有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,二、培养基的成分,水、无机盐、有机物、天然复合物、植物激素、培养体的支持材料、抗生素、活性炭等。,（一）水 是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,（二）无机元素(inor

4、ganic element),大量元素： 指浓度大于0.5mmolL的元素等。其作用是：(1)N 是细胞质、细胞核、生物膜等的组成成分，是生命不可缺少的物质。 供应形式：NO3N、NH4N。NH4N对植物生长较为有利。 供应物质：KNO3、NH4NO3、 K2SO4、氨基酸等。(2)P 是磷脂的主要成分。参与生物膜、核酸、ATP、ADP等的组成。 供应形式：磷酸二氢根、磷酸氢根 供应物质：KH2P04或NaH2P04等。 在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。,(3)K 作用：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密

5、切关系。一般为13mgL为好。供应物质：KCI、KN03等盐类提供。(4)Mg、S和Ca Mg-是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S-是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。Ca-是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用。,微量元素 指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Zn、Cu，Mo，Co等。 铁-是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分；是叶绿素形成的必要条件。对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。供应物：鳌合铁（ FeSO47H20+Na2EDTA）在制做培养基时不用Fe2（SO4）3，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)

6、3的不溶性沉淀)。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等：也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,（三）有机化合物(organic compound),培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：,碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。 蔗糖使用浓度在2%5%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖。 高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，

7、可用食用的绵白糖代替。,维生素(vitamin) 以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。VBl(盐酸硫胺素)：对愈伤组织的产生和生活力有重要作用。VB6(盐酸吡哆醇)：能促进根的生长。Vpp(烟酸)：与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc（抗坏血酸）：有防止组织变褐的作用。 (酚类物质-醌) 一般用量：0110mgL。有时用量较高。有时还使用生物素、叶酸、VB12等。,肌醇 (myoinosltol)又叫环己六醇作用：能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用。对细胞壁的形成也有作用。使用浓度：一般为lOOmgL，,氨基酸(almin

8、o acide) 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。常用的氨基酸：甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。水解乳蛋白或水解酪蛋白：它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000mgL之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。,（四）天然复合物,其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。,1)椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使

9、用浓度在10%20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nun时，椰乳就不发生作用。2)香蕉 用量为150-200mlL。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100200mgL。受酸和酶的作用易分解

10、，使用时要注意。5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,（五）植物生长调节物(hormone), 植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动。 植物激素的种类： 促进生长：生长素、细胞分裂素、赤霉素 抑制生长：脱落酸、乙烯 在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培

11、养起着决定性作用。,1. 生长素类(auxin) 主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。 IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。 NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA(indolebut

12、yri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,2. 细胞分裂素类 ( cytokinin ) 这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基腺嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6BA。作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量

13、较低。,3. GA ( gibberellic acid赤霉素) 作用： 促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株； 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响。（当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化） 赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。,激素配比模式,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向: 高 有利于根的形成和愈伤组织 的形成生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化、愈伤组织 低 有利于芽的形成生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异。一般生长素

14、浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.0510mgL。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose (0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No

15、roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,tissue culture in the African Violet,No BA,BA reduce

16、d to 0.1 mg. l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roo

17、ts and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus,No MS saltsNo sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced

18、 to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.,（六）培养材料的支持物,琼脂(agar) ：是最好的固化剂。是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水(90)中，成为溶胶，冷却至40 即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量:在610gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩

19、散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力:与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,固体培养基的优点：操作简便，易于解决通气问题，便于经常观察研究 固体培养基的缺点：培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。其他 ：有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响

20、较小。,（七）抗生物质(antibiotic),抗生物质：青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。 -对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。 注意: - 抗生素对植物组织的生长也有抑制作用; - 某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应; - 在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施 - 在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。,（八）活性炭(active carbon),活性炭木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用。使用

21、浓度：0.5l0gL。,活性炭的应用,1、具抑褐作用：可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，一般使用浓度为0.1%0.2%，不能超过0.2%。2、活性炭对生根培养有明显的促进作用：其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。3、可降低玻璃化苗的产生频率：在培养基中加入0.3%活性炭，对防止产生玻璃苗有良好作用。,三 培养基的制

22、备,（一）、母液(stock solution)（贮备液）的配制和保存 欲配制液的浓缩液。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。作用：保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取； 便于低温保藏。注意： 1.离子之间发生沉淀，如Ca2+ 和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后，会产生沉淀，要充分溶解再放入母液中。 2.要用蒸馏水或重蒸馏水。 3. 药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。 4.母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。 5.母液配好后放人冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,母液的配制方法：将几类

23、营养成分按配方中的用量扩大一定倍数（ a ）称量，分别溶解后，混合在一起，定容到一定体积配成混合母液，浓度可用a xmg/L表示，即配制一升培养基吸取该母液1000/a ml.生长素：用少量95%酒精助溶。配成1mgml。2，4D：用0.1molL的NaOH或KOH助溶，温水定容。细胞分裂素类：少量1N盐酸溶解后，加入温水冷却后定容。铁盐（MS为例）：在装有400ml 蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至500ml，置于冰箱中备用。（200 a ）,(二) 培养基的

24、配制及其灭菌,培养基的配制方法1. 将母液按顺序排列、检查是否失效（沉淀或变色2. 在有适量蒸馏水(3/4)的容器中加入适量琼脂和糖 加热溶化3. 依次吸取各种母液和生长调节物质移到容器中4. 用蒸馏水定容5. 调节pH值(用0.1M的NaOH或HCl调节)6. 进行分装（20-30ml/瓶）,培养基的灭菌,方法： 详见第四章（操作技术）,思考题,1MS固体培养基的主要成分包括哪些？2根据已知条件，计算配制650ml培养基各母液的用量，并写出在实验室配制该培养基的各操作步骤。已知： . 培养基配方：MS+6-BA1.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+0.4%琼脂粉。 . 实验室有如下母液:10倍的大量元素；50倍的微量元素；100倍的铁盐；100倍的有机物；1mg/ml的6-BA；1mg/ml的2,4-D。 . 若干琼脂粉和蔗糖。3固体培养与液体培养各有何优缺点？4配置培养基时，常用的植物生长调节剂都是哪些？各有何作用。5琼脂有什么作用？1例L培养基通常加多少g琼脂？6常用培养基有哪些？它们各有何特点？举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程。,