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1、引物设计实例分析,1,t课件,引物设计基本原则,引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值 (melting temperature)G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin）阅读框,2,t课件,1. 引物的长度,一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶(Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。 对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可
2、以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使片段3端凸出一个A,应注意)的最适温度,3,t课件,2.产物的长度,扩增片段长度为100600碱基对.,4,t课件,3. Tm值,引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G),5,t课件,4. 引物的GC含量,有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低
3、都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,6,t课件,5.碱基础随机分布,引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。,7,t课件,6. 引物自身,引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败,引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。,8,t课件,7. 引物之间,两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应
4、多于4个连续碱基的同源性或互补性。,9,t课件,8.引物的3端,引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，,10,t课件,9.引物的5端,引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。,11,t课件,10.密码子的简并,如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。,12,t课件,11.引物的特异性,引物与非
5、特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。,13,t课件,任务设计DJ-1蛋白表达引物,14,t课件,Plasmid 1:,15,t课件,Plasmid 2,16,t课件,第一步：检索DJ-1mRNA基本序列,LOCUS NM_057143 1097 bp mRNA linear ROD,1 gtgccgagca cagttactgg aaggcttaac caaagttttg atgcctggga accgcgcagg61 aaaaacacgc ggaacgtgct tcacagtggc ggctaactgc tctcgttcgc tgtgcagagc121 cgtctgg
6、cag ggttgacctc ctaaagggat attccatctt tattaatcat tagtagtgtg181 gtcagagact tagcaccatt ggtctccccc aacctggtcc agacatttca gcagtttatc241 ggaacagcaa caacagcaac aaaaccttca aaatttacaa gtctttaaga aatagaaatg301 gcatccaaaa gagctctggt catcctagcc aaaggagcag aggagatgga gacagtgatt361 cctgtggaca tcatgcggcg agctgggat
7、t aaagtcaccg ttgcaggctt ggctgggaag421 gaccccgtgc agtgtagccg tgatgtagtg atttgtccgg ataccagtct ggaagaagca481 aaaacacagg gaccatacga tgtggttgtt cttccaggag gaaatctggg tgcacagaac541 ttatctgagt cggctttggt gaaggagatc ctcaaggagc aggagaacag gaagggcctc 601 atagctgcca tctgtgcggg tcctacggcc ctgctggctc acgaagtagg
8、 ctttggatgc 661 aaggttacat cgcacccatt ggctaaggac aaaatgatga acggcagtca ctacagctac 721 tcagagagcc gtgtggagaa ggacggcctc atcctcacca gccgtgggcc tgggaccagc 781 ttcgagtttg cgctggccat tgtggaggca ctcagtggca aggacatggc taaccaagtg 841 aaggccccgc ttgttctcaa agactagaga gcccaagccc tggaccctgg acccccaggc 901 tgag
9、caggca ttggaagccc actagtgtgt ccacagccca gtgaacctgg cattggaagc 961 ccactagtgt gtccacagcc cagtgaacct caggaactaa cgtgtgaagt agcccgctgc 1021 tcaggaatct cgccctggct ctgtactatt ctgagccttg ctagtagaat aaacagttcc 1081 ccaagctcct gacggct,17,t课件,第二步：利用Primer Premier 5设计引物,Primer1: 5 ATGGCATCCAAAAGAG .Primer2: 5
10、 TCTAGTCTTTGAGAACA .,18,t课件,Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能 。,19,t课件,打开程序首先进入的是序列编辑参看,20,t课件,这是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范
11、围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。,21,t课件,Automatic Search 自动搜索,22,t课件,在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。,23,t课件,PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构。在左下的两排按钮可以显示发现了何种二级结构，也显示二级结构的自由能数值G 单位kcal/mol。,24,t课件,Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列。可以使用
12、CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列,并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法。进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活，用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式，也可以手工键入引物序列。一旦引物被编辑发点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物。,25,t课件,引物长度引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度.对越多数实验适宜引物长度为18到24个碱基,等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建library protocol ,28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到
13、重要作用。长PCR引物能给扩增带来更好的特异性,长引物也允许通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度,不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互补等二级结构。理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡。,26,t课件,为设计一条高效引物有几个参数必须考虑PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次如下Tm 融链温度：PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链温度。PCR反应的合适Tm范围为56到63C。GC% GC含量：对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来
14、说GC含量至少应为50%。Degeneracy 多义性：当设计多义引物时应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。3 End Stability 3 末端稳定性：引物稳定性影响它的错配效率。一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端，如果引物3 稳定性强有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩secondary bands。 而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。,27,t课件,GC Clamp GC钳：引物与目的位点的有效
15、结合需要有稳定的5 末端，这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。,28,t课件,Secondary Structures 二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量。发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率。形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。,29,t课件,Hairpin 发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成,引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对.发卡结构的稳定性可以用自由能衡量,自由能大小取决于碱基配
16、对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量,如果自由能值大于0 则该结构不稳定,从而不会干扰反应.如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。按下按钮All 可以显示其具体结构。,30,t课件,Dimer 二聚体引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增，产物二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3 末端问题会更为严重，3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增使用Dimer Report功能可以预测二聚体的形成。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5 ，二聚体和发夹结构形成的能值越高越稳定
17、，越不符合要求。,31,t课件,False Priming 错配如果引物可以结合除目的位点外的其他区域扩增效率将明显降低，目的产物带将减少或出现涂布（smear ），PRIMER PREMIER会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成局部的错配，3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对。可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。,32,t课件,Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效，是因为在同样退火温度下，Tm低的引物决定扩增的特异性，而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始。PRIMER PR
18、EMIER会计算每一对引物的匹配度100分为满分并按照分数按降序排列计。,33,t课件,Pair Rating,Formula for Determining Single Primer Rating Rating = 100 - (G (Dimer)1.7 +G (Hairpin) )1.4 +G (False Priming)1.5) Formula for Determining Primer Pair Rating Rating = Average of sense and anti-sense primer rating - (Tm difference between primer
19、s) * 1.7) - (DG Cross Dimer) * 1.3),34,t课件,第三步：酶切位点,Primer1: 5 ATGGCATCCAAAAGAG （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 TCTAGTCTTTGAGAACA （GC:57%,Tm：66）,EcoR I : GAATTC,Primer1: 5 GAATTC ATGGCATCCAAAAGAG Primer2: 5 GGTACC TCTAGTCTTTGAGAACA,Kpn I： GGTACC,35,t课件,第四步 保护碱基,Primer1: 5 CCGGAATTCATGGCATCCAAAAGAGPrimer2:
20、5 CGG GGTACC TCTAGTCTTTGAGAACA,http:/,36,t课件,第五步 blast验证引物,进入网页：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/,37,t课件,点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项,38,t课件,在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： 注：文献报道ABCG2的引物为5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-TGCCCATCACAACATCATCT-3简便的做法是同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5 3。 输入上游引物后，加上20个字母n，再输入下游引物，如下
21、图：,39,t课件,在Choose Search Set栏中： Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript或Others (nr etc.)。,40,t课件,在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：,41,t课件,在此界面最下面关键要点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。,42,t课件,在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word
22、 size的下拉框将数字改为7。如下图：,43,t课件,图中代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分图中代表这些序列与引物匹配的得分值位于4050分图中代表这些序列与引物匹配的得分值位于50-80分，图中代表这些序列与引物匹配的得分值位于80-120分分值越高，特异性越好。线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。没有连线的，表示单条引物与该基因一致。 点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。,44,t课件,Accession、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息Desscription、系列的简单描述 Total score高的就是有两线段间有连线的，如图划线的。 E value：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。,45,t课件,46,t课件,
