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1、,第五章 PCR技术及原理（4学时）,研究生课程,Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize,第一节 PCR的原理,各种型号的PCR仪,聚合酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction),Kary B. Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,PCR技术基础：体内DNA的复制,DNA聚合酶（I
2、II III）,拓扑异构酶解旋酶类SSB,引物dNTP Mg2+,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、PCR基本工作原理,PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n (n 为循环次数),PCR扩增的平台效应（plateau effect）,PCR扩增的平台效应,是不是cycles越多越好？,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+,二、PCR体系基本组分,三、PCR的反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,根据PCR反应，能否设计一个简易PCR仪？,简易的PCR反应,四、PCR技术的特点,1、高度灵敏性；2、高度特异性；3、样
3、品广泛的适应性；4、操作简单。,1、高度的灵敏性,PCR产物每轮循环增加一倍； 30轮循环后，扩增量达100万个拷贝（109拷贝）。,2、高度的特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,所谓特异性：只扩增引物之间的DNA！,（1）在高度保守区,与非扩增区无同源性。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）3端为关键碱基；5端无严格限制。,引物设计原则,5端照抄，3
4、端互补。,引物的快速设计,引物设计举例,GCAATATGGCGATCGATCATACGTTACGGCATAATCCGACTA?,如何快速设计1对引物，将红色区域的DNA片段扩增出来？,3、适用样品的广泛性,既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。,4、操作简便易行,PCR扩增，只需数小时，就可以扩增出大量的DNA片段，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。,
5、五、几种重要的PCR衍生技术,1、不对称PCR技术；2、反向PCR技术；3、多重PCR技术；4、引物标记PCR技术；5、实时PCR技术。.,1、不对称PCR,目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物，其最佳比例一般是0.010.5M。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究。,2、反向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3、多重PCR,在同一PCR体系中加入若干对P
6、CR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或检测缺失设置内对照。,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,DMD基因外显子缺失的检测,在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。,4、L
7、P-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断。可同时检测多种基因成分。,标记引物,观察,PCR产物,5、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增。,PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列,对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,6
8、、PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。,7、原位PCR,操作步骤1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2. PCR扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,8、逆转录PCR（
9、RT-PCR）,以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等。,逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物。以oligo(dT)作为引物， mRNA3末端polyA尾与之互补。以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。,reverse transcription,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,cDNA,RT-PCR,9、荧光定量 PCR（real-time PCR),通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪,实时在
10、线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。,实时PCR技术原理,实时荧光定量PCR仪,梯度PCR仪,普通PCR仪,实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数,CEA 基因在消化系统上皮腺癌，尤其是直结肠癌和胃癌中高表达， 因此在肿瘤细胞内可检测到其转录本，而在正常成人体内极少表达。,正常成人体内CEA基因表达,胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达,在肿瘤发生血道转移时，外周血中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、特异的技术检测到这些肿瘤细胞中CEA基因的转录本，是发现肿瘤早期转移的关键。,10、基因的体外诱变,11、增效PCR（booster PCR）,当扩增少于1000拷
11、贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经1520个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。,12、巢式PCR（nest PCR）,此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片
12、段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。,13、差异显示PCR（differential display ）,一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。,差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR),5,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3,Poly(A) RNA,5 T12MN 3锚定引物,逆转录,5,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,变性,5,MNAAAAAAAAAAA
13、A(A)n 3,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,退火,5 T12MN 3锚定引物寡核苷酸随机引物,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,延长,dNTP、Taq聚合酶,3,M N TTTTTTTTTTTT 5,5,MNAAAAAAAAAAA 3,变性、退火、延伸,电泳,显示,T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C),启动cDNA第一链合成,不同长度的PCR产物,回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对,随机结合到cDNA链上,将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。
14、,14、PCR-单链构象多态性分析PCR-SSCP,（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）,PCR-SSCP分析原理示意,- primer - 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 .,解链,构像,DNA,原 理,过 程,PCR-SSCP过程,用PCR-SSCP技术发现我第一例 LDH遗传变异病例,病 例 21岁男性： LDH：75 U/L (参考范围：110-240 U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LD
15、H活力始终处于较低水平，在 48-85 U/L之间,经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。,LDH-A基因变异类型_变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失A-220 A
16、AA-GAA Lys-Glu 电荷变化A-314 CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化A-20 插入C 移码突变A-128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合A-213 丢失2 bp (CT) 移码突变A-251 丢失20 bp 移码突变,LDH-B基因变异类型变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响B-6 AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化B-35 GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合B-103 8bp重复 移码突变B-131 AGT-CGT Ser-Arg 辅酶结合B-139 丢失2 bp (TC) 移码突变B-145 4bp重复 移码突变B-147 TAT-T
17、AG Tyr-Ter 无义突变B-171 CGC-CCC Arg-Pro 基质结合B-172 TTT-GTT Phe-Val 基质结合B-173 CGC-CAC Arg-His P轴的安定性B-176 ATG-TTG Met-Leu 分子稳定性B-287 丢失1bp(C) 移码突变B-320 GAT-GTT Asp-Val 电荷变化,六、PCR技术在医学上的应用,人类疾病的发生，常涉及到内源基因的改变和外源基因的侵入。前者可引起各种遗传性疾病或肿瘤；后者如细菌、病毒、寄生虫等感染机体，把它们的基因也带入人体。不论其致病是否由基因所致，也不管其基因是否整合到人体基因组中，只要病原体存在，机体就会
18、有其核酸存在，因此PCR及其相关技术的发展为临床诊断提供了行之有效的方法。,1. 目的基因的克隆2. 基因的体外突变3. DNA和RNA的微量分析4. DNA序列测定5. 基因突变分析,重组体,1、基因克隆,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,2、基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),3、遗传病的诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,A,正常人,病 人,正常,病人,ASO探针法,A,C,T,G,ASO探针,正常,病人,PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因
19、的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交,探针杂交,NC膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,4、恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,HLA系统基因分型,PCR-RFLP法,PCR-SSO法,PCR-SSCP,PCR-SSP,5、基因配型,PCR-SSP,1 2 3 4 5 6 7 8,PCR,1 2 3 4 5 6 7 8,引物特异性,（序列特异性引物-PCR技术 ）,6、基因鉴定,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,7、甲基化特异性MS-PCR,DNA甲基化是表观遗传学的重要部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤
20、发生中起重要作用。如在一般正常的细胞中，基因调控区CpG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈现甲基化状态。,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,将DNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。在MS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异性的引物（primer），一对为非甲基化的引物（primer），进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，最终可以确定研究DNA片段部位的甲基化情况。,Methylation specific PCR, MS-PCR模板甲
21、基化处理：Na2SO3 C-U需设计特异性甲基化引物G:C/A:U,7、法医学分析,个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序,PCR-VNTR多态性检测,PCR；电泳检测,（VNTR：数目可变的串联重复序列 ）,父 父 子 母,DNA fragmentscompared afterelectrophoresis,Crime scene,Suspect 1,Suspect 2,PCR,现 嫌1 嫌2 嫌3,8、DNA多态性,DNA多态（DNA Polymorphism）： DNA区域中等位基因(或片段)存
22、在两种或两种以上形式,对基因没有影响,称为DNA 多态。 群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。 常用做遗传分析中的标记-遗传标记,DNA分析中常用的多态性标记有3类,1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性：短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。,一、序列多态（或点多态）,限制性片段长度多态性（Re
23、striction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 由于碱基的变异可能导致限制酶切点的消失或新的酶切点出现，从而引起不同个体的DNA在用同一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为RFLP。非常有用的遗传标记，所含的信息量有限。,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLPSouthern blot检测结果,Allele II 产生了新的酶切点,镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变,血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所致的遗传性疾病
24、。前者称为异常血红蛋白病，后者称为地中海贫血。针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是由于珠蛋白基因的第6位密码子GAG突变成GTG，导致蛋白结构异常。对此遗传病的基因诊断可采用PCR-限制性内切酶分析技术。,5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,二、序列长度多态性（或数目变异串联重 复，variable number tendom repeats, VNTR）,重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列。散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式形成多态。如图：VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。,VNTR 酶切，电泳后的检测结果,PCR-VNTR检测,通常，重复单位628bp长，称为小卫星DNA。 重复单位26bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）,
