微生物初级教材课件.ppt

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1、微生物检定 初级培训,微生物检定工大纲,基本要求： 1、职业道德基本知识:身体健康无传染性疾病，有良好的卫生习惯和质量无差错意识、了解药品管理法、药品生产质量管理规范等法律与法规相关知识；有强烈的责任感。2、基础理论知识：应用化学、应用微生物学、生物化学。 3、专业基础知识：药品、食品、化妆品及日化产品卫生标准4、专业知识：药品卫生标准知识、质量管理基本知识。卫生检验基本技术知识，常用工具设备使用基本知识，常见供试品、原材料、中间体一般性能知识。,基本要求：,5、专业相关知识：药品检验、食品检验、化妆品及日化产品检验、洁净操作和安全操作知识。药品、食品、化妆品及日化产品卫生微生物检验和鉴定技术

2、知识，工具设备使用和维护知识，供试品、原材料、中间体性能和鉴别知识。6、质量管理知识：药品生产质量管理规范相关知识、一般卫生检验岗位的质量保证措施与责任。7、安全文明生产与环境保护知识：微生物检定安全操作与劳动保护基本知识，常见废品处理方法等环境保护基本知识。药品生产质量管理规范、卫生检验部门的质量保证措施与责任。,2022/12/3,培训讲师 吴华英,4,微生物检定工大纲,见深圳市劳动局网站参考资料： 1.中华人民共和国药典（2005版）， 国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年；2.药品生物检定技术，汪穗福主编，中国医药科技出版社，1999年7月；3.中国药品检验标准操作规范（200

3、5年版），中国药品生物制品检定所编，中国医药科技出版社，2005年2月；4.微生物学教程（第二版）周德庆，高等教育出版社； 5.微生物学实验沈萍等，高等教育出版社，2003年印（第二版）；6.中华人民共和国药品管理法 （年月日）7.药品生产质量管理规范(1998年修订)(1999年3月18日)8.中国医学微生物菌种保藏管理办法卫生部 1985年颁布9.使用有毒物品作业场所劳动保护条例（年月日） 10.中华人民共和国职业病防治法 (2001年10月27日),药品生物测定技术，汪穗福主编，化学工业出版社，2005年8月；,考试题型,Click to edit text styles,Edit yo

4、ur company slogan,微生物限度检查 考核内容,细菌的总数检查,药品中细菌的计数检查是检测药物在单位质量或体积内所含有的活菌数量，用以判断药品被污染的程度和标志。细菌数越多，表面药品受到致病菌污染的机会和可能性也较大，安全性也就越差。同时细菌数计数测定也包括药物的各种原料，工具设备，操作人员及工艺流程等各个环节的卫生状况和GMP评价的一个综合依据之一。,细菌，霉菌总数计数,细菌菌数报告规则,细菌数宜选取平均菌落数在30300之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。*如有1个稀释级平均菌落数在30300之间，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。*如同时有2个稀释级平均菌落数在3030

5、0之间时，计算比值：比值=高稀释级的平均菌落数稀释倍数/低稀释级的平均菌落数稀释倍数当比值2时，以两稀释级的均值报告；当比值2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。*如同时有3个稀释级平均菌落数在30300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告。*如各稀释级的平均菌落数均不在30300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。,大肠埃希菌的介绍,大肠埃希菌为肠杆菌科埃希菌属代表菌。现被列为粪便污染指示菌，是口服药品常规必检项目。生物学特性1. 形态与染色2. 培养与生化反应3. 抵抗力,大肠埃希氏菌检查,1. 增菌培养 BL2. MUG-Indole检查3. 分离培养

6、 EMB平板4. 生化实验 I M V-P C5. 结果判断,制片：涂菌 ，干燥 ， 固定 染色：1）结晶紫初染1min 2）碘液媒染 1min 3） 95乙醇脱色30s 4）番红液复染 2min显微镜检查,革兰氏染色法,分离培养,取供试液BL培养基分别在伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。菌落呈紫黑色、紫红色、红色、圆形，扁平或潲凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润然后置361温箱内，培养1824h后取出，如有菌落生长，挑选菌落做IMVC实验，并做革兰氏染色。,生化鉴定,挑选EMB划线分离培养的23个可疑菌落：靛基质试验（I）蛋白胨水培养基中，培养24小时甲基红试验（M）磷酸盐葡萄糖胨水培养

7、基中，培养48小时2小时乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时2小时枸橼酸盐利用试验（C）枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养4872小时,靛基质试验（I）,甲基红试验（M）,枸橼酸盐利用试验（C）,大肠菌群分布,大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。,大肠菌群限度检查法,1.1取样及稀释方法： 与菌落总数检验方法相同，做成1：10的均匀稀释液为

8、检样。1.2乳糖发酵试验 选择3个稀释度，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管。接种1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌中混合接种于1支单料乳糖胆盐发酵管作对照。 置361温箱内，培养242h，1.3分离培养 将产气的发酵管分别在伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置361温箱内，培养1824h后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。1.4证实试验1.5结果判断,沙门菌特性,沙门菌为肠杆菌科沙门菌属细菌，是人畜共患得肠道病原菌。广泛分布于自然界，常引起伤寒，肠炎，肠热症和食物中毒，危害人类健康。药典规定：含动物组织或动物类原药材粉的口服

9、给药制剂，每10g或10ml不得检出沙门菌。,沙门菌检查,供试品 100ml供试液复苏培养：100ml营养肉汤 36*1，培养1824h增菌培养：四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)10ml， 361，培养1824小时 。分离培养：DHL琼脂或EMB琼脂，培养242小时 。初步筛选试验：三糖铁琼脂培养基斜面 TSI生化鉴定：脲酶试验-，氰化钾试验 -，赖氨酸脱羧酶试验+ ，动力检查+，血清凝聚试验+，靛基质,沙门菌在胆盐硫乳琼脂(DHL)上显无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。,沙门菌 在TSI琼脂上的反应,铜绿假单胞菌 菌体特性,绿脓杆菌（铜绿假单胞菌 ）是假单胞菌属的代表菌种

10、，在琼脂平板上能产生蓝绿色绿脓素，烧伤、烫伤、眼科疾患常感染伤口时形成绿色脓液。（外用药品不得检出铜绿假单胞菌）可造成眼角膜溃疡，失明，败血症等严重疾患。本菌为无荚膜、无芽胞、能运动的革兰氏阴性菌，形态不一，成对排列或短链状，为专性需氧菌，最适宜生长温度为37，致病性绿脓杆菌在41时仍能生长。,铜绿假单胞菌检查,供试品 10-1供试液增菌培养：胆盐乳糖培养基100ml， 361，培养1824小时 。分离培养：溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，培养1824小时 。纯培养：营养琼脂，培养1824小时 。生化鉴定：氧化酶试验 ，绿脓菌素试验 +，硝酸盐还原产气试验，42生长试验，明胶液化实验。,铜绿假单

11、胞菌分离结果,除阴性对照外，其余2份培养液划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养1824小时。结果：菌落呈扁平，无定型，周边扩散，表面湿润，灰白色，周围有蓝绿色扩散。,金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37C，最适生长pH 7.4。革兰氏染色阳性。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。金黄色葡萄球菌分布在皮肤，腔道，空气，土壤，水，物品表面。引起局部和全身化脓性炎症，严重导致败血症，脓毒血症。,金黄色葡萄球菌检查,1. 增菌培养 亚碲酸钠或营养肉汤培养基。2.分离培养：甘露醇高盐琼脂或卵黄氯化钠琼脂3. 革兰氏

12、染色镜检4. 血浆凝固酶试验,平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。,革兰氏染色阳性,金黄色葡萄球菌分离结果,金黄色葡萄球菌的菌落在甘露醇高盐琼脂平板上呈金黄色，圆形, 凸起、边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.71mm。,无菌检查法,无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。(无菌注射剂,手术用眼药等)无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。,注射剂无菌检查,1、最低检验量（查表）：直接接种法取供试品数：11支（瓶）2、接种（提问：培养温度、时间、方法）需气菌、厌气菌：培养基15ml/管，硫乙醇酸盐液体培养基（1）样品：5管，全量（2）阳性对照：1管，同上+金

13、黄色葡萄球菌液1ml（3）阴性对照：1管，无菌生理盐水1ml真菌：培养基15ml/管，改良马丁培养基（1）样品，同上5管（3）阴性对照：1管，无菌生理盐水1ml,微生物检验,大肠杆菌的分离培养检查阳性结果应为阳性、靛基质阳性口服液的微生物限度检查项目大肠杆菌，细菌，霉菌铜绿假单胞菌的检查所用的对照菌种铜绿假单胞菌绿脓杆菌增菌培养后阳性对照、样品对照都为浑浊，阴性对照不浑浊，应做以下分离培养。常见控制菌（致病菌）绿脓杆菌检查，分离培养阴性对照应无菌生长。除阴性对照外，取其余2份培养液划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板培养。绿脓杆菌分离培养阴性对照应无菌生长、阳性对照有菌生长、样品平板上有疑似菌

14、落生长应做下一步纯培养实验。铜绿假单胞菌在分离培养的形态是灰白色 。,微生物检验,微生物限度检查 细菌总数实验中所用的培养基营养琼脂培养基 ；霉菌计数所用的培养基一般为玫瑰红钠琼脂培养基；酵母菌计数所用的培养基一般为酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养；大肠杆菌增菌培养所用的培养基一般为胆盐乳糖培养（BL）TSI培养基是指: 三糖铁琼脂培养基TTB培养基是指:四硫磺酸钠亮绿培养基SS培养基是指：沙门、志贺菌司琼脂培养基DHL培养基是指：胆盐硫乳琼脂培养基 YPD琼脂培养基是指:酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基EMB琼脂培养基是指：曙红亚甲蓝琼脂培养基,1. 检验技术知识,1.掌握微生物检定基本原理及相关概念

15、；2.掌握所用检定菌的接种，培养，保藏，各种培养基制备的知识；3.掌握常用的消毒剂及相关试剂的使用知识；4.掌握影响微生物检定及无菌检验（无菌操作程序和要求，微生物限度检测，样品稀释等）的因素；5.掌握无菌操作程序；6.掌握判断检测过程中出现的异常现象知识。,普通微生物知识,微生物学的奠基人是巴斯德 微生物特别适合作为遗传学研究对象的优点繁殖周期短 ；培养条件简单 ； 表型性状丰富细菌的特征有：多数以二分裂方式繁殖 ； 构造简单 ；水生性较强细胞壁的主要功能：固定细胞外形 ； 赋予细菌特定的抗原性 ；为细胞生长分裂所必须属于单细胞真菌的是酵母菌在受氮磷等元素污染后发生富营养化的海水赤潮和湖泊水

16、华的元凶，是某些蓝细菌,普通微生物知识,TCA途径称为三羧酸途径EMP途径称为糖酵解途径HMP途径称为：己糖一磷酸途径关于支原体的叙述：介于独立生活和细胞内寄生生活间 ；最小型原核生物 ；细胞膜含有甾醇；无细胞壁 ；原核微生物可以分为“三菌”，包括放线菌 ；细菌 ；蓝细菌生物氧化的特点不包括一步式快速反应 ；包括条件温和 ；有酶参加 ；大部分生成ATPL 型细菌专指通过自发突变而形成的遗传稳定的细胞缺损菌株,普通微生物知识,广泛分布于自然界，有“先锋生物”之美称的微生物是酵母菌；酵母菌最常见的繁殖方式为芽殖。一般以单细胞状态存在；能发酵糖类产能。属于丝状真菌的是霉菌； 属于大型子实体真菌的是蕈

17、菌；蓝细菌的特征的是：进化历史悠久 ；能进行产氧性光合作用 ；大型原核生物防腐的方法包括低温 ； 缺氧 ；干燥剂等湿热灭菌常用121高压蒸汽灭菌20min；干热灭菌160，2h,普通微生物知识,消毒是指：杀死物体上的病原微生物常用的碘液浓度为： 2.5% 乙醇消毒剂常用的浓度为：75杀灭芽孢最常用和最有效的方法是：高压蒸汽灭菌法高锰酸钾属于氧化剂的消毒剂常用于空气或物体表面消毒的是：紫外；常用于血清除菌的是：滤过除菌法；湿热灭菌法中效果最好的是，常用于手术器械或基础培养基灭菌的是：高压蒸汽灭菌法；适用于接种环，针的灭菌的最彻底的干热灭菌法是灼烧 。用来测量细菌大小的单位是um；琼脂在98以上溶

18、于水，以下凝固。配制固体培养基一般加1.42.0%的琼脂，半固体0.20.7%,2. 工具设备知识,1.掌握常用设备的名称，规格，型号，结构，性能，材质，使用维护，安全保护知识和仪器正确使用知识，了解工作原理2.掌握常用计量器具，仪器，仪表，电器的名称，型号，规格，使用，维护及安全知识。,工具设备知识,1. 普通光学显微镜2.手提式压力蒸汽灭菌锅湿热灭菌3.恒温水浴锅4.电热恒温干燥箱干热灭菌5.水浴恒温震荡器6.生化培养箱,7.超净工作台8.菌落计数器9.紫外可见分光光度计10.无菌室要求11.激光尘埃粒子计数器 12.抑菌圈自动分析仪,显微镜使用,用显微镜的油镜观察时，在载玻片上滴加的镜油

19、是香柏油；操作显微镜的油镜观察物体时，操作的顺序是，油镜头的放大倍数为100倍显微镜的工作环境要求最大相对湿度为：85%；工作环境要求室温为：040显微镜选用目镜10倍，物镜40倍，总放大倍数为400显微镜视野里有脏物，直接原因可能是目镜上有脏物 ；物镜有脏物 ；玻片上有脏物 显微镜图象某一侧发暗，原因可能是转换器不在定位处显微镜图象略带黄色，原因可能是未用兰色滤光片,手提式压力蒸汽灭菌锅,手提式压力蒸汽灭菌锅，盖上面装有安全阀，压力超过0.14MpA.后，能自动跳起，释放过高的压力。消毒液体结束时，必须等压力指针到达0MpA后方可排放余气。 手提式压力蒸汽灭菌锅，消毒液体时，应将液体装在硬质

20、的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好。 手提式压力蒸汽灭菌锅，消毒液体时，应将液体装在硬质的耐热玻璃瓶中，瓶口选用棉花塞 。干热灭菌一般在160170 ,12h进行 ，电烘箱内温度降到70以下后，才可以打开箱门，取出灭菌物品 。电热恒温干燥箱工作室 设有进风孔，空气流动方向是：箱底进，箱顶出 ，耐热物品适宜放入箱内作高温烘焙实验。,生化培养箱,生化培养箱具有制冷和加热的调温系统，是实验室常用的设备之一。生化培养箱的箱体的隔热材料采用聚胺酯泡沫塑料，对冷热源具有较强的抗干扰能力。箱体的内腔采用工程塑料材料制成，具有较强的抗腐蚀能力 。为保护生化培养箱的制冷压缩机，控制线路设计有断电保护和4分钟

21、延时的功能。生化培养箱的培养架上的样品，放置要保持适当间隔 ，有利于空气的循环。生化培养箱低温使用时，尽量避免腔壁上凝结水珠，主要是为了避免污染。经常不关箱门属于不正确使用和维护生化培养箱的做法是。,法律法规,药品管理法第1条，2 ，712，32，34，35，38，43，44，48，49，51，52，54，56, 68，84,102。.药品生产质量管理规范(1998年修订)第5条,3136,62中国医学微生物菌种保藏管理办法 1, 2使用有毒物品作业场所劳动保护条例14, 36, 39, 57,5 8, 59.劳动保护知识问答 69，16，19，22，23，40，49，65，67，73，74,

22、例题,1（2）. 在我国境内，除从事药品监督管理的单位或者个人外，还有哪些单位或者个人必须遵守药品管理法？ABCDA. 从事药品研制的； B. 从事药品生产的； C. 从事药品使用的；D. 从事药品经营的； E. 从事药物科学研究的。2（8）. 药品管理法规定，开办药品生产企业必须具有哪几类依法经过资格认定的人员？BCEA. 医学技术人员； B. 药学技术人员； C. 工程技术人员；D. 监督管理人员； E. 相应的技术工人。3（7）.药品生产许可证应当标明什么内容？A. 有效期； B. 生产批号； C. 生产范围； D. 药品批准文号； E. 生产品种。,4. 工会劳动保护监督检查的三个条例

23、是什么？A.工会劳动保护监督检查员工作条例；B.基层工会劳动保护监督检查委员会工作条例；C.工会小组劳动保护检查员工作条例；D.工会成员代表大会组织条例；E.工会委员选举产生实施条例。5.划分因工伤亡事故和非因工伤亡事故应掌握哪三个基本要素？只有同时具有以上三个基本要素，才能定为因工伤亡事故，否则，缺任何一个要素，都属非因工伤亡事故。A.工作时间（含加班加点）内发生的；B.工作地点，即发生在生产（工作）岗位上或企事业生产（工作）活动所涉及的区域内；C.工作性质，即因从事生产（工作）而引起，或与生产（工作）有关，或从事对社会有益的工作（活动）而引起；D.工作内容，E.工作人员,5. 对一般生产区

24、的生产人员的要求下列哪些说法是正确的？A. 直接接触药品的生产人员至少每年体检一次，建立健康档案；B. 仅限于该区域生产操作人员和经批准的人员进入；C. 直接接触药品的操作人员不得化妆；D. 患有传染病、隐性传染病、精神病者不得从事药品生产工作；E. 经常洗澡、理发、刮胡须、修剪指甲、换洗衣服，保持个人清洁。,药品卫生标准,供试品的检验量每批供试品检验量一般为10g或10ml。除另有规定外，中药膜剂检验量为3035 cm2 化学药及生化药膜剂检验量为10cm2，贵重 的或微量包装的供试品检验量可以酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。供式品须取自2个以上的包装单位，大蜜丸、膜剂除须取自2个以上的包装单位外，应取自4丸(片)以上样品。,例如：,紫药水需要检查的限度检查 无需检查 。葡萄糖注射液需要检查的项目有无菌检查太太口服液需要检查的项目有细菌、霉菌总数 、大肠杆菌红霉素需要做的项目有抗生素效价测定感康胶囊需要做的项目有细菌、霉菌总数 、大肠杆菌 糖浆剂需要做的项目有细菌、霉菌总数 、大肠杆菌 作无菌检查的有注射液，滴眼液，粉针剂。含动物脏器的口服液要做细菌、霉菌，大肠杆菌，沙门菌检查。,2022/12/3,培训讲师 吴华英,52,Thank You !,Add your company slogan,