微生物在食品环境中的生长课件.ppt

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1、第六章 微生物在食品环境中的生长,生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加,生长,指生物个体数目的增加,繁殖,在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物生长的指标。,群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程,第一节 微生的生长,一、微生物纯培养的获得,平板划线分离法,稀释倒平板法,单孢子或单细胞分离法,利用选择性培养基分离法,1.平板划线分离法,用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经

2、培养后，可在平板表面得到单菌落。,2.稀释倒平板法,3.单孢子或单细胞分离法,采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。,在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。,4.选择性培养基分离法,各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。,微生物纯培养分离方法的比较,二、 微生物生长的测定,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)

3、作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,微生物生长,微生物生长测量方法,个体计数法,重 量 法,生理指标法,1.个体计数法,a.直接法,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,b.间接法,原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。,2.重量法,通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,C.比浊法,以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物

4、量；,三、单细胞微生物的生长曲线,细菌纯培养生长曲线图,（一）、微生物生长曲线的意义反映微生物生长繁殖和衰退的规律营养和环境影响的衡量指标控制微生物生长发育的依据,（二）生长曲线的四个主要时期,滞留适应期(或称延滞期)(lag phase) 刚刚接种到培养基上的细菌，对新环境有一个短暂的调整或适应过程。）特点(1)一般不立即开始分裂繁殖，生长速率常数为零。 (2)合成代谢活跃，细胞重量增加，体积增大。 (3)DNA含量高，细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质体嗜碱性。 (4)对外界不良条件的反应敏感。,）原因(1)缺乏代谢所需的酶。 (2)缺乏代谢所需的中间产物。 ）影响延滞期长短的因素

5、主要有：菌种、接种龄、接种量、培养成份等。,2 对数生长期(logarithmic phase) 1).特点 (1)细胞代谢活性最强。 (2)细胞进行平衡生长 。(3)生长速率最大。 在一定条件下(如营养成分、温度、pH和通气量等)，每一种微生物的世代时间(或称培增时间)是恒定的，是微生物菌种的一个重要特征。,以分裂增殖时间除以分裂增殖代数(n)，即可求出每增殖一代所需的时间(G)。设对数期开始时的时间为t1，菌数为X1，对数期结束时的时间为t2，菌数为X2，则 t2- t1世代时间 (G) = nX2=X12n, 用对数表示为lgX2=lgX1+nlg2(lgX2-lgX1) 因为n= 而l

6、g20.301 lg2所以n=3.32(lgX2-lgX1) t2- t1即世代时间 (G) = 3.32(lgX2-lgX1),不同细菌其对数生长期中的代时不同，同一种细菌在不同培养基组分和不同环境条件下，如培养温度、培养基pH，营养料性质等，其代时也不同。但各种细菌在一定条件下，其代时是相对稳定的。化学组成和生理特性等均较一致，代时稳定，代谢旺盛，生长迅速，是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子，用处于对数生长期的菌进行接种可以缩短滞留适应期，以缩短发酵生产周期。影响对数期微生物代时的因素很多，主要有：菌种、营养成分、营养物浓度、培养温度等。,稳定期(stationary pha

7、se)又称最高生长期 1)特点 (1)生长速率常数为零。 (2)细菌数达到最高水平。 (3)细胞内开始积累贮藏物质。 (4)大多数芽孢细菌在此时形成芽孢。 (5)次生代谢产物的积累逐渐增多。,2)原因 (1)营养物特别是生长限制因子的耗尽。 (2)有害代谢产物的积累。 (3)pH等条件的改变。 稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物，例如单细胞蛋白、乳酸等为目的一些发酵生产的最佳收获期，也是对某些生长因子例如维生素和氨基酸进行生物测定的必要前提。,衰亡期(decline Phase) 1)特点 (1)群体出现负增长。 (2)菌体形态出现多样。 (3)次生代谢产物开始产生或者释放。 2)

8、原因 环境变得不适合于细菌的生长。,四、连续培养,连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物,连续培养类型,恒浊连续培养,恒化连续培养,(一)恒化连续培养,在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。,生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质,恒

9、化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。,(二)恒浊连续培养,通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。,用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,(三)连续发酵与单批发酵相比,优点：缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,（五）同步培养把群体内的细胞分裂同步化，这种培养叫同步培养法，利用同步培养技术使它们处于同一生长阶段，使所有的细胞都能同时分裂，这种生长方法叫同步生长。 1、筛选法又称淘析法，主要有过滤法、区带密度梯度离心法和膜洗脱法等。 （

10、1）、过滤法 是将微生物细胞用滤器过滤、让处于细胞周期较早阶段的小细胞通过，收集这些细胞。转入新鲜培养基中，即能获得同步细胞。,（2）区带密度梯度离心法是将随机生长的细胞悬浮置于蔗糖梯度溶液表面，然后离心，不同生长周期的细胞由于体积和质量大小不同，沉降系数不同，同一生长周期的细胞就聚集在离心液的一个区带上，小细胞在上，大细胞在下。这方法可便于收集处于较早周期的小细胞，本法已成功地应用于芽殖和裂殖酵母、大肠杆菌等细胞的同步培养。（3）膜洗脱法本法是根据某些滤膜可以吸附与该膜相反的电荷的细胞而设计的，可获得比上述两法数量更大，同步性更高的细胞,2、诱导法诱导法是利用一些生理学手段强制微生物达到同步

11、生长的目的。（1）化学诱导利用停止或限制供给微生物细胞分裂所必需的某种养料，使所有的细胞都进入临分裂状态(但不分裂)，然后在某一时刻恢复供给细胞分裂所必需的养分，就能诱导出同步细胞群体。 （2）物理诱导是利用某些物理因子，使处于即将分裂的细胞的代谢活动受到抑制，从而使细胞在分裂阶段前停止，以求得以后分裂的同步。例如温度，就是基于细胞周期不同，相对地对温度，就是感性也不同。其它物理因子如脉冲(对光合微生物)、射线等也能诱导同步生长。,五、影响微生物生长的环境因素,主要分为物理因素、化学因素和生物因素生物因素：互生（mutualism）拮抗 (antagonism)共生 (symbiosis)寄生

12、 (parasitism)猎食 (predation),下一节,所谓互生，是指两种可以单独生活的生物，当它们生活在一起时，通过各自的代谢活动而有利于对方，或偏利于一方的一种生活方式。因此，这是一种“可分可合，合比分好”的相互关系。例如，当好氧性自生固氮菌与纤维分解细菌生活在一起时，后者因分解纤维素而产生的有机酸可供前者用于固氮，而前者所固定的有机氮化物则可满足后者对氮素养料的需要,返回,拮抗：微生物之间对营养、氧气的争夺，或是一种微生物在其生命活动过程中能产生一种对他种微生物呈现有害作用的代谢产物，或者改变其他环境条件，从而抑制其他种微生物的生长发育甚至毒害或者杀死他种微生物的关系例如，在生物

13、防治过程中利用酵母与水果致病菌之间的拮抗 作用来保鲜水果,返回,共生又叫互利共生,是两种生物彼此互相依赖，彼此获益地生存在一起一类种间关系,叶状地衣,壳状地衣,丝状地衣,返回,枝状地衣,寄生 是一种生物从另一种的体液、组织或已消化物质获取营养并造成对宿主危害，更严格说，寄生物从较大的宿主组织中摄取营养物，是一种弱者依附于强者的情况。例如，蛭弧菌寄生与大肠杆菌或者其他G-菌体内,返回,某些原生动物和真菌能猎取细菌及孢子为食物的现象称为猎食,返回,第二节 食品的营养组成与微生物的生长,一、食品原料的营养成分 蛋白质脂肪 碳水化合物 无机盐类 维生素,微生物分解营养物质的选择性,第三节 影响微生物生

14、长的主要因素,温度 氧气物理因素 干燥 渗透压 超声波与微波,酸、碱与pH 重金属及其化合物 表面消毒剂 有机化合物（酚类、醇类、醛类） 卤族元素及其化合物 表面活性剂（新洁尔灭、杜灭芬）化学因素 染料 抗代谢药物：磺胺类等 化学治疗剂 抗生素 中草药有效成分,一、温度,最低生长温度: 指微生物能进行繁殖的最低温度界限。最适生长温度：指使微生物迅速生长的温度 。最高生长温度：指微生物生长繁殖的最高温度界限。致死温度:致死微生物的最低温度界限。致死时间: 在一定温度下杀死微生物所需要的最短时间。,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物分为：低温微生物、中温微生物和高温微生物，它们的生长温度如

15、下表：,各类微生物生长的温度范围,各种细菌的芽孢在湿热中的致死温度和致死时间,高温对微生物生长的影响,高温菌耐高温机理酶对热稳定核酸G+C%较高,Tm值较大细胞膜长链脂肪酸含量高,主要是一些分支的长链饱和脂肪酸(17, 18和19碳原子)保护因子,如金属离子(Mg2+,Ca2+等)和一些低分子物质如多胺等高温菌的生长特性： 生长曲线的各个时期均短暂，因此常会在腐败食品中检测不到，这在食品检验中要特别注意,高温菌及其生长最高温度,微生物耐热性大小的几种表示方法： 热力致死时间：在特定的温度及其它条件下，杀死一定数量的微生物所需要的时间 F值：在一定的基质中，温度为121.1，加热杀死一定数量微生

16、物所需的时间 D 值：利用一定温度进行加热，活菌数减少一个对数周期（即90%活菌被杀死）所需的时间 Z值：在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）所需要升高的温度,影响微生物对热抵抗力的因素： 菌种的遗传特性 菌龄 微生物的数量 基质的特性（组成、浓度、理化条件） 加热的时间与温度,低温对微生物生长的影响,低温微生物耐低温的原因： 胞内酶耐低温；细胞膜中不饱和脂肪酸的含量高。低于冰点的温度对微生物的影响： 水分的丧失；冰晶对细胞膜的物理损伤。 速冻、缓冻与反复冻溶对微生物细胞的影响,低温的用途,菌种保藏 液氮的温度（-195）、干冰温度（-70 ）、-20 和4 （常加

17、大分子保护剂如糊精、血清白蛋白等）食品冷藏 冷藏（0-4 ）与动藏（-18 ）,二、水分,水是微生物细胞的重要成分，占生活细胞的90以上，它参与细胞内的各种生理活动，因此说没有水就没有生命。降低物质的含水量直至干燥，就可以抑制微生物生长，防止食品、衣物等物质的腐败与霉变。因此干燥是保存各种物质的重要手段之一。,（一）水活性值（activity of water） 水分活度(aw )是溶液中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比，称为水分活度，可近似的表示为溶液中水蒸气气压与纯水中气压之： aw =P/P0 =ERH/100 P为溶液后食品中的水蒸气分压 P0为纯水的蒸气压 ERH是平衡相对

18、湿度即物料既不吸湿也不散湿时的大气相对湿度。,(二)不同类群微生物的生长和水活性,食品水分活性与微生物生长活动,微生物生长所需要的aw值的可变性,影响因素：温度 有氧和无氧环境 pH 有害物质存在,三、氧气,根据微生物生长与氧气的关系，可将微生物分为以下几种： 专性好氧菌：在正常大气压下进行好氧呼吸产能好氧菌 兼性厌氧菌：以呼吸为主，兼营发酵或无氧呼吸产能 微好氧菌：只能在0.01-0.03巴大气压下生活 厌氧菌 耐氧菌：只能以发酵产能，但分子氧无毒害 专性厌氧菌：只能生长在无氧或基本无氧条件下，氧剧毒过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、细胞色素氧化酶的分布情况,氧气影响微生物生长的机制,厌氧菌氧毒害

19、的机制： 由于厌氧菌细胞内缺乏SOD，无法消除02.- ，后者反应力很强，性质极不稳定，在细胞内可破坏各种重要的生物大分子和膜，也可形成其他活性氧化物，对生物非常有害好氧与耐氧菌驱除02.-机制：,氧化还原电位势,好氧微生物： +0.1 V；最适 +0.3至 +0.4V；厌氧微生物：-0.1V;产甲烷细菌： -330 mV；,微生物生长过程中培养基氧化还原电位的变化,辐 射,不同波长的射线对微生物的作用不同，可见光部分（400-800纳米）往往能被某些光合微生物所利用，而波长较短的紫外线（13.6-400纳米）、X-射线（0.06-13.6纳米）、r-射线（0.01-0.14纳米）均可抑制甚至

20、杀死微生物。尤其是r-射线因作用距离较远、穿透力较强而用于食品的杀菌保藏。,渗透压,微生物生长与渗透压的关系（高渗透压、低渗透压对微生物生长的影响）根据微生物对高渗透压耐性的不同，将其分为以下三类： 高度嗜盐细菌（20-30%食盐溶液中生长） 嗜盐细菌 中等嗜盐细菌（5-18%的食盐溶液中生长） 低等嗜盐细菌（2-5%的食盐溶液中生长） 耐盐细菌（可在10%以下的食盐溶液中生长） 耐糖细菌（可在60%以下的含糖高渗溶液中生长）* 普通微生物一般在0.85-0.90的食盐溶液中生长,H值,根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链

21、霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌不同的微生物最适生长的pH值不同，同一种微生物在不同的生理阶段对pH值的要求也不同，在发酵工业中，控制pH值尤其重要，如黑曲霉在pH2-2.5主要产柠檬酸， pH2.5-6.5 以菌体生长为主，pH7时以合成草酸为主各类微生物生长的最适pH值：细菌为6.5-7.5 ，放线菌为7.5-8.0，霉菌和酵母菌为 4-6,各种微生物的生长与pH,鲜乳中的微生物活动曲线,H对微生物生长的影响,由于氢离子与细胞膜上的酶相互作用,氢离子也影响细胞壁中的酶活性;pH值影响培养基中有机化合物的离子化,从而间接影响微生

22、物;pH值影响营养物质的溶解度;pH影响代谢产物的积累;抑制杂菌生长.,H对有机酸渗入细胞的影响,酸碱添加剂的抑菌机理,无机酸可增加氢离子的浓度，引起菌体表面蛋白的变性和核酸的水解，并破坏酶类的活性作为食品防腐剂的有机酸如苯甲酸和水杨酸可与微生物细胞中的成分发生氧化作用，从而抑制微生物的生长防腐：利用理化因素完全抑制霉腐微生物生长繁殖的措施碱类物质可引起细胞物质的水解或凝结，以杀死或抑制微生物，食品工业中常用石灰水、NaOH、Na2CO3等作为机器、工具以及冷藏库的消毒剂,几种常用表面消毒剂及其应用,表面消毒剂：对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内化学治疗用的化学药剂,第四节 环境中微生物的

23、抑制、杀灭与防止,（一）、消毒、灭菌和防腐消毒(disinfection)：杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒剂(disinfectant)。灭菌(sterilization)：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。,商业灭菌(commercial sterilization)：食品经过杀菌处理后,按照所规定的微生物检验方法,在所检食品中无活的微生物检出,或者仅能检出极少数的非病原微生物，并且它们在食品保藏过程中,是不可能进行生长繁殖的,这种灭菌方法,就叫做商业灭菌 抑菌(ba

24、cteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。防腐(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。无菌(asepsis)：不存在活菌。,热力灭菌法辐射杀菌法滤过除菌法超声波杀菌法干燥与低温抑菌法,（二） 物理消毒灭菌法,干热灭菌法 焚烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械湿热灭菌法 巴氏消毒法：61.6-62.8 30min或71.715-30s, 主要用于牛乳消毒。 超高温法：只要在135-150下维持2-6s 煮沸法 流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法 高压蒸汽灭菌法,一. 热力灭菌法,紫外线

25、波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。 其主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两 个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。电离辐射 高速电子、X射线、射线，使其他物质氧化或产生自由基(OH、H)破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。 微波 波长1mm1m，通过热产生杀死微生物的作用,二. 辐射杀菌法,赛氏滤器玻璃滤器薄膜滤器,三. 滤过除菌法,不耐热的液体培养基的灭菌,是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。,四. 超声波杀菌法,干燥法 低温法：低温可使细菌的新陈代谢减慢，常用作保存细菌菌种。冷冻真空干燥法是目前保存菌种的最好方法。,五. 干燥低温抑菌法,消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷化剂。消毒剂的应用：病人排泄物与分泌物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空气、手。,（三） 化学消毒灭菌法,消毒剂的性质、浓度与作用时间微生物的种类与数量温度酸碱度有机物,（四） 影响消毒灭菌效果的因素,