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1、第三章生物样品与样品制备,教学要求,掌握血样的采集和制备的方法；掌握离线生物样品制备方法如去除蛋白质方法；熟悉液-液萃取法、固相萃取法；了解在线生物样品制备方法。,第一节 生物样品的种类、采集、制备与贮存,一、生物样品的种类、采集和制备,生物样品：包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆液、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。 最常用的为：血浆和血清。,（一）血液,l血样的采集 目前使用较多的方法是从静脉采血。根据血中药物浓度和分析方法灵敏度的要求，一般每次采血15ml。 2血样的制备 (1)血浆的制备：是将采集的静脉血液置含有抗凝剂的离心管中，混合后，以25003000
2、rpm离心5l0min，使血浆与血细胞分离，所得淡黄色上清液即为血浆。,(2)血清的制备：采集的静脉血液置离心管中，放置30min到1h。用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去凝固在试管壁上的血饼，再2 5003000rpm离心5l0min，上层澄清的淡黄色液体即为血清。(3)全血的制备：将采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞混合在二起，则称为全血 。,（二）尿液,尿药测定主要用于药物剂量回收研究、药物的尿清除率，并可推断患者是否违反医嘱用药，同时根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型等。由于易受食物种类、饮水多少、排汗情况等影响，常使尿药浓度变化较大。
3、,（三）唾液,标本制备：唾液的采集一般在漱口后15min左右，应尽可能在刺激少的安静状态下进行，用插入漏斗的试管接收口腔内自然流出的唾液，采集的时间至少要10min。 唾液样品易收集，病人易接受，与血浆或血清相比，可避免针头穿刺血管时引起的感染，是一种非伤害性方法 。,适用于药物：卡马西平，苯妥英，扑米酮等。 不适用于药物：苯巴比妥、普鲁卡因胺、奎尼丁、丙吡胺、利多卡因以及抗抑郁药阿米替林、去甲替林锂盐、甲氨蝶呤、乙琥胺等。,（四）组织,在过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器的贮存情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息，常常需要采集肝、脾、肾、肺、胃、脑等脏器及其他组
4、织进行药物检测。 处理方法匀浆化法 、沉淀蛋白法 、酸水解或碱水解 、酶水解法 。,（五）头发,毛发样品可进行微量元素含量测定，可用于：药物史的估计临床用药物和滥用药物的区别毒性药物的检测缺点：实验材料的预处理繁杂、干扰多。分析对象的含量低，需要精密仪器测定。,二、生物样品的贮存与处理,(一) 冷藏或冷冻短期保存时，可置冰箱(4)中长期保存时，须置冷冻柜(-20C至-80C)中(二) 去活性: 为防止含酶样品在采样后酶对被测组分进一步代谢、采样后必须立即终止酶的活性。 液氮中快速冷冻微波照射匀浆及沉淀加入酶活性阻断或抗氧化剂样品煮沸,第二节 离线生物样品制备,一、生物样品预处理目的,使药物从其
5、缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总浓度；生物样品介质组成复杂，干扰多，而药物组分是微量的，必须先经预处理，使纯化、富集；为了适应和符合测定方法的灵敏度 ；为了防止分析仪器被污染、劣化，保证仪器测定的准度、精度和特异性。,二、生物样品预处理应考虑的问题,自学,三、离线生物样品制备方法,生物样品的预处理方法：有机破坏法去除蛋白法分离、纯化和浓集法缀合物的水解化学衍生化法,（一）有机破坏法,湿法破坏干法破坏氧瓶燃烧法,（二）去除蛋白法,目的： 去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化，还可以保护仪器(如保护HPLC柱不被污染，延长使用期限) 。,1加入与水相混溶的有机溶剂,原理：加入水
6、溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。血浆与水溶性有机溶剂的体积比为1113时，可将90以上的蛋白质除去。通常采用超速离心 (10000rmin)离心l2min可将析出的蛋白质完全沉淀。,2加入中性盐,加人中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水分子置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。,3加入强酸,原理：当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶
7、性盐而沉淀。常用的强酸有：l0三氯醋酸、6高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5偏磷酸等。,4加入含锌盐及铜盐的沉淀剂,原理：当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等。,5超滤法,超滤法是以多孔性半透膜超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术。超滤不需要加热，不需要添加化学试剂，操作条件温和，没有相态变化，具有破坏性小，能量消耗少，工艺流程短等优点。,6酶水解法,组织匀浆中加入一定量酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用。 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它
8、不仅可使组织溶解，并可使药物析出。枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH范围(pH7.011.0)内使蛋白的肽键降解，在5060C具有最大活力。,7加热法,当欲测组分热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀。蛋白沉淀后可用离心或过滤除去，这种方法最简单，但只能除去热变性蛋白。,（三）分离、纯化及浓集,1. 液液萃取法（LLE）,原理是基于被测组分在不相容的两种溶剂中分配系数的差异，而实现分离的一种经典萃取方法。一方面，多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度；另一方面，血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是亲水性的；因而用有机溶剂萃取一次即可除去
9、大部分杂质，从大量的样品中萃取药物经浓集后作为分析用样品。,优点： 分离后萃取液可被蒸发，组分易于富集，因此，操作简单快速，经济实用。缺点：易产生乳化现象萃取液易挥发，有毒性，易污染环境不能实现自动萃取。,2.固相萃取法（SPE法）,SPE原理：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到“吸附”、“分配”、“离子交换”或其他作用，药物或杂质被保留在固定相上。洗脱杂质或洗脱药物。,有两种洗脱方式：一种是杂质与固定相的亲和力强，药物被直接洗脱；另一种是药物与固定相的亲和力强，杂质被洗脱；然后用一种亲和力更强的溶剂洗脱药物。,常用的聚丙烯SPE柱：长约23cm自行填料
10、装柱从市场上购买,使用方法： 将样品溶解在适当的溶剂中，加到微型柱上端，用以下方法使溶剂加速通过SPE柱：在下端用真空泵抽上端用注射器加正压离心,SPE柱的类型： 1）亲脂性键合相硅胶2）大孔吸附树脂3）离子交换树脂4）亲水型填料,SPE的优缺点优点引入杂质少；完全避免乳化的形成；在优化条件下有较高的萃取率，重现性也较好；可以用较少量的样品；柱子为可弃性柱，无污染；使用的溶剂大多可与水混合，易于自动化。,缺点：价格贵；技术要求高；批与批之间有一定的差异；柱子易阻塞，影响分离效果，样品需经预处理。,（四）缀合物的水解,缀合物：药物或其代谢产物与内源性物质结合的产物，常为葡萄糖醛酸苷缀合物和硫酸酯
11、缀合物。尿中药物多为缀合物。,1、水解法酸水解：可加入适量的盐酸溶液 酶水解：葡萄糖醛酸苷酶/硫酸酯酶2、溶剂解 缀合物(主要是硫酸酯)往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解，称作溶剂解。,（五）化学衍生化在HPLC法中的应用,HPLC的常用检测器：紫外吸收检测器荧光检测器电化学检测器,衍生化的目的：提高对样品的检测灵敏度；改善样品混合物的分离度；适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外、核磁共振等。,衍生化的方法,1、紫外衍生化：很多化合物在紫外光区无吸收或摩尔吸收系数很小而不能被检测，将它们与具有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下反应，使生成具有紫外吸收的衍生物，从而可以被紫外检测器检测。,紫
12、外衍生化试剂包括：苯甲酰甲基溴和萘甲酰甲基溴类试剂(适于羧酸)芳香胺类试剂(适于羧酸)酰氯类试剂(适于羟基)异氰酸苯酯(PIC)(适于羟基) 2，4-二硝基苯肼(2，4-DNPH)(适于羰基) 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(适于羰基)取代苯甲酰氯类试剂(适于伯胺、仲胺)芳基磺酰氯类试剂(适于伯胺，仲胺)硝基苯类试剂(适于伯胺，仲胺)异氰酸酯和异硫氰酸酯(适于伯胺、仲胺),2、荧光衍生化反应荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性的检测器，比紫外检测的灵敏度高10100倍，适合痕量分析。阿霉素、普萘洛尔、奎尼丁等少数药物有荧光，在HPLC条件下可以被检测。脂肪酸、氨基酸、胺类、生物碱、甾
13、体类药物等本身不具荧光，必须与荧光衍生试剂反应，生成具有强荧光衍生物才能达到痕量检测的目的。,荧光衍生化试剂包括：荧光胺(适于伯胺)邻苯二醛(适于伯胺)丹酰氯(适于伯胺，仲胺等)氯化硝基苯骈氧二氮茂(适于伯胺、仲胺、羟基)邻苯二胺(适于羧酸),3、电化学衍生化反应：电化学检测器灵敏度高、选择性强，但只能检测具有电化学活性的化合物。电化学衍生化是指药物与某些试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物，以便在电化学检测器上被检测。,常用试剂包括：酰氯和酸酐类试剂(适于胺类、氨基酸)二茂铁类试剂(适于胺类、氨基酸)对氨基苯酚(AP)(适于羧酸)对-硝基苯肼(p-NPH)(适于羰基),4、手性衍生化法：采用
14、手性衍生化试剂将药物对映异构体转变为相应的非对映异构体，用常规非手性HPLC法进行分离分析。选用该法分离通常基于以下原因：不宜直接拆分，生成中性化合物后其色谱行为则获得显著改善；添加某些基团，以增加色谱系统的对映异构选择性；提高紫外或荧光检测的效果。,手性衍生化试剂：伯胺和仲胺的手性衍生化试剂，如-甲基苯乙酰氨等； 伯醇和仲醇的手性衍生试剂，如苄酯基-L-脯氨酸等；羧基的手性衍生试剂，如甲基-对硝基苯胺等。,第三节 在线生物样品制备（自学）,柱切换高效液相色谱法限进填料高效液相色谱法（RAM-HPLC）微透析技术与HPLC、HPCE、GC、MS联用,前处理示例,庆大霉素血药浓度测定（见教材P54）,
