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1、第二章 生 物 催 化 剂,第一节 生物催化剂的来源与多样性 第二节 生物催化剂的发现与筛选 第三节 国内外酶制剂的工业概况 第四节 生物催化剂的发酵生产,第一节 生物催化剂的来源与多样性,一、基本概念定义：是生物反应过程中起催化作用的游离细胞、游离酶、固定化细胞或固定化酶的总称。 （一）分类：1、按结构形态：细胞、酶、多细胞生物体2、按形式：游离型催化剂、固定化型催化剂,（二）分离纯化酶和微生物整细胞体系的优缺点,二、生物催化剂的来源与多样性,生物催化剂来源的多样性体现在微生物的多样性。土壤、水域、动植物、极端环境、特殊环境,第二节 生物催化剂的发现和筛选,对于一个特定的生物转化过程，生物催
2、化剂的筛选和制备是非常重要的一个环节，因为其活性、选择性和稳定性的高低将直接影响生物催化过程的效率，也是关系将来能否实现大规模产业化应用的关键因素之一。要获得一个具有潜在工业化应用前景的优良生物催化剂，往往要经过微生物菌种的自然分离、诱变育种或定向改造，酶的发酵、提取和纯化，以及酶或细胞的固定化等一系列环节。有时还要采用基因克隆、蛋白质工程和定向进化等分子生物学方法进一步提高菌种的产酶水平或者改变酶的催化性能。,第二节 生物催化剂的发现和筛选,一方面， 我们设计一个新的酶促反应过程时，必须找到一个适合这个反应的酶，另一方面，新酶的发现也为设计新的酶促过程提供新的思路。发现新酶最有效和成功的方法
3、之一，就是从微生物生活的自然界筛选获得一定数量的微生物菌种。,微生物酶筛选的策略,常规生物催化剂发现的一般过程：（一）设计反应过程（二）选择合适的酶或产酶微生物（三）建立有效且方便的分析方法。,（一）生物催化剂筛选中的反应过程设计 在设计目标化合物合成的酶促反应过程中，选择合适的反应底物、合适的反应途径以及目标化合物的性质都非常重要。,（一）生物催化剂筛选中的反应过程设计,酰胺烷基化,D-脱酰胺酶,D-海因酶,自发消旋化,5-单取代海因,（一）生物催化剂筛选中的反应过程设计,产生多种副产物,Rhodococcus rhodochrous,微生物酶筛选的策略,（二）选择合适的酶或产酶微生物1、途
4、径和方法（1）从国内外市售的商品酶和菌种保藏机构保藏的相关微生物中发现目标催化剂；（2）从土壤、污染区等自然环境中分离筛选具有新的催化活力的催化剂；（3）从已有的酶中发现新的非天然催化活力；（4）利用新的反应条件、改变反应介质或寻找新的影响因子；（5）采用基因工程、蛋白质工程等技术获取新的催化剂。,（二）酶或产酶微生物的筛选,一般产酶微生物筛选的原则1、能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶2、微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶3、微生物所产生的酶最好有比较高的专一性4、所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的 安全微生物5、微生物的遗传稳定性应该比较高,1、途径和方法,（1
5、）从国内外市售的商品酶和菌种保藏机构保藏的相关微生物中发现目标催化剂；只能提供少数几个有限的催化剂来源 世界主要酶制剂公司,丹麦 novo nordisk 诺和诺德：世界著名生物制药和生化制品集团公司，成立于1923年，凭借自身的研发实力成为世界糖尿病治疗领域先导，在行业内拥有为广泛的糖尿病治疗产品，生产的胰 岛素和酶制剂分别占世界市场份额的50%和40%以上。,我国主要菌种保藏单位及其隶属机构,著名的国际菌种保藏机构,（2）从土壤、污染区等自然环境中分离筛选具有新的催化活力的催化剂；（3）从已有的酶中发现新的非天然催化活力；（4）利用新的反应条件、改变反应介质或寻找新的影响因子；（5）采用基
6、因工程、蛋白质工程等技术获取新的催化剂。,（三）建立有效和方便的筛选分析方法,高温是筛选嗜热酶嗜热菌的有效方法；目标底物是最好的筛选因素；,第三节：国内外酶制剂工业概况,一 国内外酶制剂生产和应用现状二 国内外酶制剂生产应用差异三 我国酶制剂工业的若干对策建议,一 国内外酶制剂生产和应用现状,1 世界三大酶制剂公司Novo Nordisk （丹麦）Genencor International(美国）Cuitor(芬兰）三大公司销售额占世界总额的70%,2、国际市场酶制剂销售额比例 2001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元用于制药工业与精细化学工业约1.2亿1.5亿美元,3、我国酶工业发展阶
7、段,1 1965 无锡酶制剂厂 淀粉酶2 1979 糖化酶3 碱性蛋白酶4 中性蛋白酶5 1993 耐高温淀粉酶6 1998 国外大公司纷纷入驻1999年投产,国内酶制剂销售额比例,二国内外酶制剂生产应用差异,1 规模：国外多公司重组 国内重复建设、效益低2 投入： 国外：开发经费高达15%，甚至19%销售额 国内：研究、开发投入不足，占1%销售额3 开发重点 国外：大力研制、开发新酶种和新用途 国内：品种少、剂型少,三、工业用生物催化剂的要求,减少不必要的副反应，有利于选择性生物催化反应的专一性；稳定性好，包括操作稳定性与贮存稳定型批次之间的实验重复性好能够反复实验。,四、商品酶的剂型,液体
8、酶制剂固体粗酶制剂纯酶制剂固定化酶制剂,第四节 生物催化剂的发酵生产,一、微生物产酶菌种二、产酶培养基三、种子培养与发酵产酶四、微生物生长与发酵产酶动力学五、发酵条件对产酶的影响,一.常用的产酶微生物,第四节 生物催化剂的发酵生产,Escherichia coli：谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、半乳糖苷酶Bacillus subtilis：-淀粉酶、中性蛋白酶,二、产酶微生物优良菌种选育1.自然育种：未经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。 2.诱变育种：利用诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。 (1
9、) 使诱导型变为组成型选育组成型突变株 培养基中添加诱导酶抑制剂，使组成型菌株被富集。 -半乳糖苷酶的抑制剂邻硝基-D-岩藻糖苷 交替培养法：乳糖培养基 葡萄糖培养基 乳糖培养基 显色反应：不含诱导物的培养基培养菌种后，-半乳 糖苷酶酶解邻硝基苯半乳糖苷,(2)使阻遏型变为去阻遏型 A.选育营养缺陷型突变株：解除反馈阻遏 (降低末端产物浓度） B.选育结构类似物抗性突变 (代谢失调，抗反馈阻遏突变株),A.选育营养缺陷型突变株：,在直线式生物合成途径中积累中间代谢产物；利用营养缺陷型积累分支代谢 途径中的末端产物,在直线式生物合成途径中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突变株进行鸟氨酸发酵,L-G
10、lu,乙酰谷氨酸激酶,L-鸟氨酸,转氨甲酰酶,瓜氨酸,精氨酸 ？,由于合成途径中酶6(转氨甲酰酶)的缺陷，必须供应精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生长，但是这种供应要维持在亚适量水平，使菌体达到最高生长，又不引起终产物对酶 (N乙酰谷氨酸激酶)的反馈抑制，从而使鸟氨酸得以大量分泌累积。,L-谷氨酸脱氢酶,谷氨酰胺合成酶,酮戊二酸衍生类型,利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的末端产物,选育营养缺陷型突变株：紫外和化学试剂诱变后，在筛选培养基（添加脯氨酸）中生长，基础培养基中不长的为缺陷型。,选育结构类似物抗性突变：筛选抗反馈阻遏和反馈抑制突变株。这种突变属于代谢失调，即在细胞中已有大量的末端产物，仍不断合
11、成这一代谢产物。,例子：L-精氨酸的生产筛选培养基( g /L) : 基本培养基添加少量 D- Arg和脯氨酸。筛选营养缺陷型和结构类似物抗性突变株可结合使用。,三、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为四种模式，即： 同步合成型 生长偶联型 中期合成型 部分生长偶联型延续合成型 非生长偶联型 滞后合成型,1. 生长偶联型（又称同步合成型） 酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。如利用米根霉生产脂肪酶。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。,
12、2、生长偶联型中的特殊形式中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。,枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线,3.部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。,黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线,4. 非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代
13、谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。,黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线,总结：影响酶生物合成模式的主要因素 高：可在细胞停止生长后继 1）mRNA的稳定性 续合成酶 差：随着细胞停止生长而终 止酶的合成 2）培养基中阻遏物的存在 不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。 受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。,酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于：同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵 温度 。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方 面努力。,
