第二章生物药物分析与检验常用的方法课件.ppt

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1、第二章 生物药物分析与检验常用的方法,第一节 酶法第二节 电泳法第三节 理化法第四节 生物检定法,第一节 酶法,酶法包括两种类型：酶活力测定法和酶分析法。酶活力测定法是以酶为分析对象的研究，测定样品中某种酶的含量或活性。酶分析法是以酶为分析工具或分析试剂，测定样品中酶以外的其他物质的含量。两者检验对象不同原理和方法相同：以酶专一而高效催化某化学反应为基础，通过对酶促反应速度的测定或对生成物等浓度的测定而检验相应物质的含量。,一、酶活力测定法,（一）酶活力酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产

2、物的增加量来表示。酶反应的速度愈快表示酶活力愈高。,（二）酶的活力单位和比活力,1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。 酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。 其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。,另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。 Kat和U的换算关系： 1 Kat=6107U，

3、1U=16.67n Kat,酶的比活力（specific activity）：是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。 比活力越大，酶的纯度越高。酶在酶制剂中的有效含量可以用每克酶蛋白或每毫升酶蛋白含有多少酶单位来表示（U/g或U/mL）固体酶比活力=活力（U）/蛋白（mg） =总活力（U）/总蛋白（mg）,酶的转化数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用。,（三）酶活力的测定方法,常规测定酶活力的步骤：1、酶液的稀释 酶制剂是粉剂，要溶解和稀释；液体酶制剂也要稀释。从测定要求来

4、分析，要求底物浓度要远大于酶的浓度。初测时，最佳稀释倍数只能通过试验来确定,2、选择底物浓度 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配置成一定浓度的底物溶液。要求所用的底物均匀一致，达到一定的纯度。有的底物溶液要求新鲜配置，有的则可预先配置后置于冰箱中保存备用。,3、确定酶促反应的最适条件 根据资料或试验结果，确定酶促反应的最适条件，最适条件包括温度、pH、底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，不允许抑制剂存在，辅助因子不可缺少。,4、反应计时必须准确 反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液，搅拌均匀，并立即计时；达到反应时间后，要立即灭除酶活性，终止反应，并记录终止时间。 终

5、止酶反应的方法很多，常用的有：加热使酶失活；加入酶变性剂；加入酸或碱溶液，使pH远离最适pH；降低温度。,5、反应量的测定 测底物减少量或产物生成量均可。酶促反应所用底物的浓度一般都很高，少量底物的消失不易测准；而产物则是从无到有，变化明显，测定较为灵敏准确，所以大都测定产物的生成量。 酶活力测定常用的具体方法有化学分析法、滴定法、比色法、吸收光谱法、荧光法、电化学法和量气法等。,二、酶分析法,酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析对象可以是酶的底物、辅酶活化剂，甚至酶的抑制剂。 在进行这类分析时，先要根据分析对象选择适宜的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲

6、线来测定他们的浓度或含量。,1、动力学分析法 原理是通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，这样测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。 酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须恒定，被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。,酶分析法必须制备一条酶反应速度相对于相应的被测物浓度的标准曲线，以便对未知样品的量进行检验。 在测定未知样品时，所采用的反应、测定系统和制备标准曲线时所用的系统应完全相同，而且待测样品的浓度还应控制在这一曲线范围以内。,2、总变量分析法（又

7、称为平衡点法或终点法）,根据被测物质的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，然后再反应完成后，借助理化方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。该方法仅适用于底物的测定，应用时应考虑工具酶的用量与反应的平衡点。,第二节 电泳法,带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 1937 年瑞典学者 A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 ，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。,在确定的条件下，带电粒子在单位电场强

8、度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为常数，是该带电粒子的物化特征性常数。不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。 利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳极移动的胶粒带负电荷，向阴极移动的胶粒带正电荷。,金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸附阳离子，带正电荷。非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子，带负电荷。 例如，陶瓷工业中用的粘土，往往带有氧化铁，要除去氧化铁，可以把粘土和水一起搅拌成悬浮液，由于粘土粒子带负电荷，氧化铁粒子带正电荷，通电后在阳极附近会聚集

9、出很纯净的粘土。工厂除尘也用到电泳。利用电泳还可以检出被分离物，在生化和临床诊断方面发挥重要作用。,一、分类,电泳分离是基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的。根据分离原理的不同，电泳分为四类：移动界面电泳区带电泳等电聚焦电泳等速电泳,移动界面电泳是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。,区带电泳是在一定的支持物上，于均

10、一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。,等电聚焦电泳 是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。,等速电泳 是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子

11、的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接，且因“ 自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。,等速电泳原理： 将样品置于含慢离子和快离子的缓冲液中电泳，快离子的电泳迁移率大于其他所有的离子，使其后面的离子浓度降低，形成一个低电导高电势的梯度区，减慢了快离子的迁移速度，并促使后面的离子加速向前移动；而慢离子电泳迁移率小于其他所有的离子，同理会加速

12、向前移动去靠近比它迁移快的离子；结果所有的离子都被压缩在慢离子和快离子之间，以几乎相等的速度迁移。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶电泳过程中就应用了等速电泳原理。,二、基本原理三、影响因素,1、颗粒性质颗粒所带静电荷越多，粒子越小且是球形，电泳迁移率就越大。2、电场强度单位距离的电位降称为电场强度也叫电势强度。电场强度越高，带电颗粒的电泳速度就越快。,3、溶液的性质（1）pH 溶液的pH决定带电颗粒的解离程度，即决定了带电颗粒所带电荷的多少。 对蛋白质和氨基酸而言，溶液的pH离等电点越远，其所带净电荷的量就越大，电泳速度就越快；反之则越慢。为了使电泳过程中溶液的pH保持恒定，宜选用缓冲溶液。,（

13、2）离子强度 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，它取决于离子电荷的总数。若离子强度过高，带电离子能把溶液中与其电荷相反的离子吸进在自己周围形成离子扩散层，导致颗粒所带净电荷量减少，电泳速度降低。（3）溶液黏度 电泳速度与溶液黏度成反比，因此黏度越大，电泳速度就越小。,（4）电渗 因为支持物不是绝对的惰性物质，它可吸附溶液中的阳离子或阴离子，使靠近支持物的溶液相对带电，从而引起电场中溶液层的移动，这种现象称为电渗现象。 如果颗粒泳动的方向与电渗方向一致，则泳动速度加快；如果颗粒泳动的方向与电渗方向相反，则泳动速度降低。 为避免电渗现象，应尽量选择电渗作用小的支持物。,若选用的支持物不合适

14、，当电场力等于甚至小于电渗力时，则颗粒泳动速度为零甚至向反方向移动,四、电泳分析的检测方法及其应用,电泳系统的基本组成电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200600V，载体两性电解质等电聚焦电泳10002000V，固相梯度等电聚焦30008000V,外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却；凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥；灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子；电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如PVDF膜电泳洗脱仪：回收样品凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结

15、果。,电泳槽,电泳仪,梳子,电泳槽,制胶板,正极电源插孔,负极电源插孔,电源线,电泳槽,凝胶成像仪,电泳的一般过程,垂直电泳槽及灌胶模具,区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带，这是当前应用最为广泛的电泳技术。自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。稳态电泳：带电颗粒在电场的作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化。 等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分 成清晰的界面

16、，并以等速向前运动。 等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。,1 电泳按其分离的原理不同可分为：,薄膜类：分离原理生物大分子的电荷密度 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 聚酰胺薄膜电泳 凝胶类: 分离原理生物大分子的电荷密度和分子大小 淀粉凝胶电泳：很少用 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）

17、（PAGE）,2 按支持介质的不同可分为：, 薄层电泳 ； 平板电泳（水平或垂直）； 柱电泳； (4) 圆盘柱状电泳。,3 按支持介质形状不同可分为：,4 按用途不同可分为：, 分析电泳； 制备电泳； 定量免疫电泳； 连续制备电泳。,5 按所用电压不同可分为：, 低压电泳：100V500V，E210V，电泳时间较长，数小时至数天，适于分离蛋白质等生物大分子。 高压电泳：1000V5000V， E202000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。需冷却装置。,6 以区带形式分为：,（1） 盘状电泳； （2）火箭电泳。,7 按有无固体支持物分：,（1）

18、自由电泳：在溶液中进行的电泳。 显微电泳、移界电泳、柱电泳、自由流动幕电泳、 等速电泳 缺点：热效应和扩散作用造成液柱的对流和蛋白区带加宽，降低分辨率。 （2）支持物电泳：防止电泳过程中的机械干扰、温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流和扩散，使被分离物质得到更有效地分离。,纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳,(一)滤纸电泳 以滤纸作为带电质点溶液的支持物来进行的电泳称为（滤）纸电泳。按施加电压的高低分为低压电永和高压电泳。其中低压电泳分为水平型和垂直型两种。1、装置： 用滤纸作为支持载体，水平架在两个装有缓冲溶液的容器间，样品点于滤纸中央。当滤纸被缓冲液润湿后，盖上绝缘密封罩，即可输入直流电压进行

19、电泳。2、特点：(1)电压愈高，带电粒子迁移速度愈快，样品分离时间愈短。(2)装置简单，分离效果较好。,醋酸纤维薄膜 ：纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.10.15mm。 醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比有以下优点： 分离效果好。醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰。 快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性比滤纸小，吸水少，电渗作用小，电泳时大部分电流由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，完成全部电泳操作只需90 min左右。, 灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需 2l 血清，点样量甚至少到0. 1l，仅含5g的蛋白样

20、品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。 醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。,由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。,凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持物的电泳。特点：1.可以制

21、成非常均匀的凝胶，带电质点在凝 胶的孔中泳动。2.电泳操作方法简便，电泳速度快3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。4.适用于生化，免疫等定性定量测定,凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分辨率，1bp差异可区分）,琼脂糖凝胶电泳图,琼脂糖凝胶电泳,实验原理,琼脂糖凝胶电泳是分子生物学研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA或RNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。,琼脂糖简介,天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物

22、构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,聚丙烯酰胺凝胶 单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性

23、：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） SDS-PAGE是利用电泳和分子筛的双重作用达到对蛋白质进行分析分离的目的。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,