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1、第五章 微生物的生长繁殖与生存因子,第一节 微生物的生长繁殖,一、微生物生长繁殖的概念二、研究微生物生长的方法三、细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用四、微生物生长量的测定方法,一、微生物的生长繁殖的概念,微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程，这是个体生长的定义。 繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 细菌两次分裂之间的时间，称为代时（世代时间）。,二、 研究微生物生长的方法,（一）分批培养： 将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度
2、、和溶解氧量，使微生物在其中生长繁殖。 以细菌纯种培养为例,将少量细菌接种到新鲜、定量的液体培养基中进行分批培养，定时取样记数。以培养时间为横坐标，以细菌数目为纵坐标，连接各取样点坐标，会出现微生物数量由少到多，达到高峰后又由多到少的变化曲线。即细菌的生长曲线。(growth cuwe)。,（1）活细菌重量变化曲线,曲线：群体重量W(mg/l)时间t,细菌内源呼吸,及细菌大量死亡阶段,曲线t点切线斜率值=?,t重量增长速率,t,生长情况用活细菌生长曲线来描述,增长速率上升阶段,提问：为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？A.营养物丰富，细菌增殖；B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式储
3、存营养物，细菌个体重量增大,增长速率下降阶段,提问：为什么增长速率较前下降了？,增长率下,降阶段,mg/,mL,0,时间,t,活,细,胞,重,量,营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降,这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止,代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制,内源呼吸及死亡阶段,内源呼吸+毒物浓度更高 （个体）瘦死 （群体）死亡率大于出生率从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。提问：此时细菌的出生率是否为零呢？为什么？不是，利用死亡细菌的残体营养,实验室通常采用细菌的数量变化绘制生长曲线，虽然两种曲线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途。,2细菌数量生长曲
4、线,静止期,衰亡期,细菌的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便，010代表11010,总菌数,活菌数,（1）停滞期,特征：,细,菌,停,数,滞,目,期,的,对,数,值,0,时间t,提问：为什么会出现迟缓期呢？,代谢活跃，个体体积、重量增高 不立即进行细胞分裂、增殖，数量不变甚至减少,适应环境（合成相应的酶），营养储备（用于复制合成）,影响停滞期的因素：接种量接种群体菌龄营养,提问：根据上述原因选择接种何种状态的细菌迟缓期会较长？对数期的细菌、静止期或衰亡期、受损细胞、富集培养基的细菌后三种,静止期细胞基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分,受损细胞养伤修复,富集培养基细菌需要合成“自力更生”
5、酶,在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的迟缓期，迟缓期的出现会增加操作时间，降低工作效率,采用处于高效菌群对数期的菌种、增大接种量、尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除迟缓期,提问：我们可以通过哪些手段缩短迟缓期呢？,（2）对数期,所有细菌均繁殖,故称对数期。（相当于重量法细菌曲线的增长率上升阶段）,细菌数目X增长率倍率的对数与时间成正比。,特点,平均代时（繁殖一代的时间）最短提问：细菌的代时与哪些因素有关？,细,菌,数,目,的,对,对,数,数,期,值,0,时间t,如大肠杆菌在20时其代时是35条件下的2倍
6、；伤寒杆菌在含0.125的蛋白胨培养基中的代时为800min，而在含1.0时仅为40min。,繁殖速度最快,种类遗传,、个体健康情况(营养、环境条件),此时所有细菌在二分裂生长,分别测定t0时刻与t时间细菌的数量X0与X,对数期细菌代时G计算,122223(22)2)24252n,X=X0*2n,X/X0=2n,X0X024 X (X02n) (n=1、2、3),n繁殖代数,代时,（3）静止期,出生率死亡率,细,菌,缓,数,慢,目,期,的,对,静止期,对,数,衰老期,数,期,值,0 t,时间,死亡原因营养短缺、代谢毒物增多（相当于重量变化曲线中的增长率下降阶段）,（4）衰亡期,死亡率出生率（相
7、当于重量法的内源呼吸阶段）由于营养物被耗尽，细菌因缺乏营养而利用贮存物质进行内源代谢，即自身溶解。细菌在代谢过程中产生的有毒代谢产物，会抑制细菌生长繁殖。死亡率增加，活菌数减少，甚至死菌数大于新生菌数。,活性污泥法中的序批式反应器（SBR）法是将分批培养的原理应用于污水生物处理的实例。,是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,（二）连续培养(continous culture of microorganisms),（1）恒浊连续培养,恒浊培养基浊度恒定（实质是细菌数量恒定）,新鲜培养基,光电池,光源,流速控制阀,出水,很少应用,
8、反馈控制,（2）恒化连续培养,化？,新鲜培养基,流速控制阀,出水,应用：环境工程、生物工程、实验室研究（细菌生理特性研究、细菌的快速筛选等）。,流速恒定,进料营养物总量,目前, 污水连续生物处理法均类似于恒化连续培养；（流速不完全恒定）,4污(废)水连续处理中的细菌生长状态,不同的生物反应器， 细菌的生长状态可能不同！,乃至同一 反应器内不同位置处,连续生物处理中的细菌状态表,细菌的生,长阶段,应用举例,特点,停滞期,无,连续化稳定操作中没有这一阶段,对数生长期,高负荷活性污泥法(大部分区域),静止期,生物膜法,常规活性污泥法 (大部分区域),衰老期,污泥的厌氧消化,1:0.40.8BOD.d
9、- 细菌与降解BOD重量比,1:0.4以下,对数期,稳定期,衰老期,平推流式活性污泥法,四、微生物生长（数量）测定方法,（1）直接计数法 （测定微生物总数） 借助显微镜观察测定,优点：快速提问:有哪些缺点?缺点：不能区分细菌的死活分四种,1.涂片染色法,2.计数器(血球计数板）测定法,0.1ml菌液,提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(90个125) * 400 / 0.1ml =2880个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数125个小格）
10、，折算样品细菌浓度；,3.比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例,提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？5.5400万个/m l =2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，平均400万个/ml,4比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,提问：如何定量二者关系呢？,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,4比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,（1）制标准曲线（ODNo）,（2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量,浊度仪或721分光
11、光度仪,（二）间接计数法(活菌计数法),提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖提问：细菌繁殖的可见现象是什么？产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养）计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌.缺点：慢 分固体培养法和液体培养法,无菌水,1. 稀释平板计数法固体培养法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度 （10-x）菌液,菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图,各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，
12、不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第四步： 计数,细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5稀释度时菌落数为125个细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌总数的测定 。注意：作空白及取平行样（23组）均值减小误差,平均,2.稀释液体计数法,特点：液体培养、统计学查表计数又称MPN法 （或最可能数法）Most Probable Number例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能
13、生长（除非厌氧培养箱）,对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。,（1）稀释,（2）稀释接种样品,在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，,恒温37培养14天,记录变黑的试管情况,（3）培养,1ml,+9ml,培养基,提问：为什么有些试管变黑有些没有？,稀释程度、取样概率,(4)统计查表计算,根据不同稀释度变黑试管统计出数量指标三位数及其中最低稀释度（取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管数，为第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数）提问：上例情况而言统计数量是几？,查表表MPN表,320 10-4,MPN三管法测数统计表,水中大肠菌群、铁
14、细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。,个菌/毫升,细菌最可能数通过其他精确的计数法，确定的各种数量指标时细菌数量的最可能值,上面例子中数量指标“320” 对应的细菌最可能数为9.5个菌/毫升，最低稀释度为10-4，折算出样品中菌浓度为 ？个菌/毫升。,3.薄膜计数法,薄膜微孔滤膜（0.45um）,（2）滤膜培养,膜有菌面冲上,原理膜抽滤（细菌浓缩）+ 膜平板培养 + 计数,（3）统计计数提问：假如 测出250个菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？ 25050ml=5个/ml自来水样品中的细菌数量=菌落数抽滤样品的体积数,要求样品洁净如空气或饮用水。 ？堵孔、菌太多难
15、以分散,提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？减少滤液体积、无菌水稀释,(三)重量法（计算生长量）,提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？已知单个细菌的平均重量 除法计算细菌的湿重量10-1510-11g/个细胞干重约为湿重的1020。1. 干重法,方法：含菌水样在105110下进行干燥恒重（本质测水中悬浮物重量MLSS或MLVSS）。,悬浮物无机物+有机物（包括细菌）提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？高温(550)灼烧,无机物化学性质稳定，高温下不会分解提问：什么情况下可以直接用悬浮物的重量表示细菌的重量？悬浮物中绝大多数是细菌。,（1）悬浮物中绝大多数为细菌时,细胞数目
16、=MLSS个体细菌的平均干重量,恒重,或,MLSS悬浮物,（2）除细菌外还有大量无机悬浮物时,W无MLVSS挥发性悬浮物MLSS W无 =细菌群体的干重量细胞数目= MLVSS个体细菌的平均干重量,2h,MLSS,总体来说重量法方法误差较大，一般只作为菌数粗略估算如活性污泥测定（以重量MLSS、MLVSS间接表示细菌数量）,2.DNA含量法,同种细菌的DNA含量一致,可通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量,少量纯细菌培养时细菌数量的测定。精确性非常高，对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，,劳伦斯方程,KX,(四)其它生理生化指标法,提问：v指什么？,COD降解v,O2消耗v,产物产生v,？求,作试验！,提问：当你需要测定某水样中细菌数量时，你该如何选择方法？,视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取,
