第八章微生物的遗传变异课件.ppt

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1、第八章 微生物的遗传与变异,第一节遗传变异的物质基础,四个基本概念1、遗传型（genotype）：又称基因型 指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。2、表型(phenotype)： 指某一生物个体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。 代谢，发育 遗传型 + 环境条件 表型 （可能性） （现实性）3、变异(variation)： 指生物个体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。 特点：出现几率低、性状变化幅度大、新性状稳定、可遗传。4、饰变(modification)： 指外表的

2、修饰性改变，意即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 特点：出现几率高、性状变化幅度小、不可遗传。 遗传和变异是一切生物最本质的属性之一。,第一节遗传变异的物质基础,遗传变异的物质基础的认识过程：达尔文时代：“泛生论”。血里找不到微粒。孟德尔时代：基因，合子中成对。(1866)上世纪初40年代：染色体与基因行为一致，由核酸和蛋白质组成，最初认为是蛋白质。1944年后：利用微生物进行的三个著名实验，才证实核酸（DNA）是遗传变异的物质基础。,一、三个经典实验,一）、经典转化实验（分四步） 1、动物实验,2、细菌培养实验：平板培养 1）热死S菌：不长； 2）活R菌：长R

3、菌； 3）热死S菌+活R菌：长大量R菌，少量（10-6）S菌。3、S菌的无细胞抽提液实验： S菌的无细胞抽提液+活R菌，平板培养：长大量R菌，少量S菌。4、 S菌各细胞成分的转化实验：（六组） 活R菌+ S菌成分，平板培养。（1944年）,一）经典转化实验（分四步）,S菌各细胞成分的转化实验,S cell extract +DNase+ R cell R colonies,二）、噬菌体感染实验（两组）（1952年）,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,

4、以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,三）植物病毒的重建实验,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,（一）7个水平1、细胞水平：有单核和多核；DNA集中在核（拟核）中。2、细胞核水平：真核有膜，与组蛋白组成染色体；原核无膜。3、染色体水平：真核生物有不同染色体数目。 单倍体：大多 数微生物、动植物生殖细胞； 双倍体：动植物体细胞、少数微生物营养细胞、合子； 部分双倍体：原核生物。4、核酸水平：一般DNA，极少数RNA；一般双链，极少单链。5、基因水平：每个基因约含1000碱基对；原核生物：操纵子。6、密码子水

5、平：三联密码子mRNA上的三个核苷酸顺序。7、核苷酸水平：碱基水平，最低突变或交换单位。少数含稀有碱基。,细菌染色体DNA的大小和结构,真核生物的染色体结构,（二）原核生物的质粒,质粒：游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA 。1.特点： 形态上：具有超螺旋结构，分子量在106-108Da间。 遗传上：携带有核质体上所没有的基因，使微生物具有一些非生存必需的特殊功能。可自主复制，也可转移；可消除，也可整合和脱离。按其复制行为与核染色体的复制是否同步，分严紧型复制控制（stringent replication control)和松弛型复制

6、控制（relaxed replication control）。,2.质粒在基因工程应用中的操作优点： 1）、体积小，便于DNA的分离和操作； 2）、呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定； 3）、有不受核基因组控制的独立复制起始点； 4）、拷贝数多，使外源DNA可很快扩增； 5）、存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出 和选择。3.分离与鉴定：细胞裂解；与蛋白质、RNA、核质体DNA等分离；鉴定（电泳、电镜、离心）。4.种类：五类。（表7-4）,典型质粒,1、F质粒：F因子，致育因子，性因子。2、R质粒：R因子，抗性质粒。由RTF质粒和抗性决定质粒两片段结合形成。3、Col质粒

7、：产大肠杆菌素因子。4、Ti质粒：诱癌质粒。引起双子叶植物根癌。5、Ri质粒：与Ti质粒相似，诱生毛状根。6、mega质粒：巨大质粒。含一系列固N基因。7、降解性质粒：只在假单胞菌中发现。,第二节基因突变和诱变育种,一、基因突变（gene mutation） 基因突变简称突变，是变异的一类，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。突变的几率一般很低（10-6 10-9） 从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株（wild type strain），简称野生型。野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株（mutant，或突变体、突变型）。,凡能用

8、选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株称选择性突变株（selectable mutant），反之则称为非选择性突变株。,（一）突变类型,1、营养缺陷型（auxotroph） 某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。2、抗性突变型（resistant mutant） 指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性突变类型。3、条件致死突变型(conditional lethal mutant) 某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在

9、另一种条件下却无法生长、繁殖的突变类型。,4、形态突变型(morphological mutant) 指由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。5、抗原突变型(antigenic mutant) 指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。6、产量突变型(metabolic quantitative mutant) 通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称产量突变型。有两种类型：正变株（plus-mutant）、负变株（minus-mutant）,（二）突变率（mutation rate） 某一细胞（或病毒粒

10、）在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。（三）基因突变的特点 1.自 发 性：各种突变都可在无人为诱变因素处理下自发发生； 2.不对应性：突变的性状与引起的原因间无直接对应关系； 3.稀 有 性：自发突变的几率极低，一般10-6-10-9，但稳定； 4.独 立 性：某一突变既不提高也不降低其他任何基因的突变率； 5.可 诱变性：诱变剂可提高突变的几率，两种变异株无本质差别； 6.稳 定 性：是遗传物质结构上发生了稳定的变化，稳定，可遗传； 7.可 逆 性：任何性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变。,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明1、Luria 等的变量试验（fluctua

11、tion test）,2、Newcombe的涂布试验,3、Lederberg等的影印平板培养法(replica plating),(五)基因突变及机制,1、诱发突变（induced mutation ）,诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂（mutagen）。1）碱基的置换（substitution ） 转换(嘌呤间或嘧啶间) 颠换(嘌呤和嘧啶间),亚硝酸引起的使AT转换成GC过程的简式见下图,HNO2 A:T He:T Hk+T第一次复制 AT HkC 第二次复制 GC HkC,直接引起置换的诱变剂

12、,间接引起置换的诱变剂,2）移码突变（frame-shift mutation）,指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。诱变剂：ICR（美国一癌症研究所名称）类化合物： 原黄素，吖啶黄，吖啶橙等。诱变机理：至今不清。结果：加3、减3；加（减）1，短距离减（加）1；影响小。 增（减）1、2、4、5引起后面全变。,常见的致变剂及其致变作用,(a)亚硝基的脱氨作用；(b) 烷化剂和被甲基化的碱基； (c) 5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对(A=T变G三C)。,3） 染色体畸变（chromo

13、somal aberration）,某些强烈理化因子会引起DNA分子的大损伤（macrolesion） 染色体畸变。 既包括染色体结构上的缺失（deletion）、重复(duplication)、插入(insertion)、易位(translocation)和倒位(inversion)，也包括染色体数目的变化。转座（因）子：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。 其跳跃过程往往导致DNA链的断裂或重接，产生重组交换、基因启动或关闭，使突变发生。转座（因）子主要有三类：IS、Tn、Mu。,2、自发突变,自发突变（spontaneous mutation） 是指生物体在无人工干预

14、下自然发生的低频率突变。自发突变的原因:1）背景辐射和环境因素的诱变；2）微生物自身有害代谢产物的诱变效应；3）互变异构效应；（配对错误）4）环出效应。（发生缺失）,(六)紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物,(六)紫外线对DNA的损伤及其修复 1、光复活作用（photoreactivation） 把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可 出现明显降低其死亡率的现象，此即光复活作用。2、切除修复（excision repair） 是活细胞内一种用于对被UV等诱变剂损伤后DNA的修复 方式之一，又称暗修复（dark repair），这是一种不依赖 可见光，只通过

15、酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成 一段正常DNA链的核酸修复方式。,（一）自发突变与育种1、从生产中育种如：抗噬菌体感染，“上酒白种”2、定向培育优良菌株（“驯化”） 如：炭疽活菌疫苗，卡介苗（二）诱变育种诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,二、突变与育种,1、诱变育种的基本环节,1）选择简便有效的诱变剂2）挑选优良的出发菌株（original strain）3）处理单细胞或单孢子悬液4）选用最适的诱变剂量5）充分利用复合处理的协同效

16、应（synergism）6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标7）设计高效筛选方案（筛选比诱变更重要）8）创造新型筛选方法,2、诱变育种中的几个原则,1）产量突变株的筛选如：琼脂块培养法2）营养缺陷型突变株的筛选与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基基本培养基、完全培养基、补充培养基与筛选营养缺陷型突变株有关的3类遗传个体野生型(A+B+) 、营养缺陷型(A+B-)、原养型(A+B+) 营养缺陷型突变株的应用 基本理论:代谢途径、基因重组规律的标记菌种。 应用研究:生产核苷酸、氨基酸，工程菌株的亲本。,3、 三类突变株的筛选方法,第一步：诱变剂处理第二步：淘汰野生型抗生素法（细菌）、菌丝过

17、滤法（真菌）第三步：检出缺陷型夹层培养法、限量补充培养法（观大小）逐个检出法（两种培养基）、影印平板法第四步：鉴定缺陷型生长谱法（auxanography）,营养缺陷型的筛选方法,3）抗药性突变株的筛选,梯度平板法：如：选育抗异烟肼的吡哆醇高产菌株突变株： 产生了可分解异烟肼的酶； 能合成更高浓度的吡哆醇（多）获突变酵母的吡哆醇产量提高倍方法： 10mL普通培养基斜放凝固平放 10mL药物培养基凝固涂诱变酵母选厚药区菌落检验,第三节、基因重组和杂交育种,两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组（gene recomb

18、ination）或遗传重组(geneic recombination)，简称重组。基因重组是在核酸分子水平上的一个概念，是遗传物质在分子水平上的杂交。基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种在方向性、自觉性方面均比诱变进了一步。杂交育种可消除一菌株长期诱产量变难提高的障碍。,一、原核生物的基因重组,（一）转化（transformation） 1、定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化作用。通过转化方式而形成的杂交后代，称转化子（transformant）。2、感受态（competence） 感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。

19、感受态因子：胞外蛋白，膜上一组成，催化DNA吸收。降解某成 分，使受体露出。,3.转化因子：离体的DNA片段，平均约含15个基因。可是dsDNA、ssDNA，也可是质粒DNA（不重组，频率最高）。4.出现范围：原核生物中较普遍；放线菌、蓝细菌、真核微生物中也有。5.转化过程：6.转染：用提纯的病毒核酸感染宿主，产生正常病毒后代。,（二）转导（transduction）,通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子（tranductant）。1.普遍转导（general

20、ized transduction） 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。1）完全普遍转导2）流产普遍转导,2.局限转导（restricted ransduction）,指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体细胞中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。低频转导（LFT）：溶源菌的前噬菌体“误切”并“误包”的缺陷噬菌体（10-4-10-6） ，感染可形成局限转导子。转导子失去溶源化能力、免疫力。高频转导（HFT）：用高感染复数(m.o.i.) 的LFT裂解物去感染受体菌，可获双重溶源菌

21、；其诱导可产高频转导裂解物；再用低m.o.i. 的它去感染另一受体菌，可高频率地（50%）把受体菌转导成转导子。,大肠杆菌l噬菌体介导的转导,(a) 普遍性转导 (b) 局限性转导,普遍性转导与局限性转导的异同,相同点：均以噬菌体为媒介，导致遗传物质的转移。不同点： 普 通 性 转 导 局 限 性 转 导1）能够转导的基因： 供体菌的几乎任何基因 供体菌的少数基因。 2）噬菌体的位置： 不整合到寄主染色体上。 整合到寄主染色体上。3）转导噬菌体的获得：可通过裂解反应得到。 只能通过诱导溶源菌得到。4）转导子的性质： 属非溶源型，转导的 属缺陷溶源型，转导 物质主要是供体菌的 的物质有供体的DN

22、A DNA。 和噬菌体DNA。,3.溶源转变（lysogenic conversion）,当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象，称为溶源转变。与转导的不同： 1）是噬菌体基因，不是供体菌基因； 2）噬菌体不缺陷； 3）不形成转导子； 4）噬菌体消失，新性状同时消失。,（三）接合（conjugation,mating）,1、定义 供体菌(“雄性”)通过性菌毛与受体菌(“雌性”)直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。 通过接合获得新遗传性状的受

23、体细胞，称为接合子（conjugant）。,2、E.coli的4种接合型菌株,1）F+菌株即雄性菌株，指细胞内存在一至几个游离态F质粒，并在细胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。2）F-菌株即雌性菌株，指细胞中无F质粒，细胞表面也无性菌毛的菌株。3）Hfr菌株即高频重组菌株。 F质粒为整合态。4）F，菌株：当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊F质粒，称F质粒或F因子。,F质粒的整合,（四）原生质体融合（protoplast fusion）,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗

24、传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。由此法获得的重组子，称为融合子(fusant)。种类：细菌、放线菌、酵母、霉菌；动植物细胞。范围：菌株间，种间；属间，科间；或更远缘。重组频率：很高，有些已大于10-1。（诱变10-6）操作步骤：,二、真核微生物的基因重组,杂交：指在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。真核微生物的主要基因重组方式：有性杂交：两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组；准性杂交：同种而不同菌株的体细胞间发生的融合，导致低 频率基因重组；原生质体融合：人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的 原生质体进行融合；遗传转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部 分遗传性

25、状。,一）有性杂交（sexual hybridization）,一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和 随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。操作步骤：(以酿酒酵母为例)1.产子囊及孢子：甲、乙亲本产孢子培养基培养；2.单倍体菌落：水洗，破坏子囊，离心，涂平板；3.双倍体有性杂交后代：不同性别单倍体密集接触；4.筛选：找出双倍体；选出优良性状的个体。,二）准性杂交(parasexual hybridization),准性生殖：是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生的融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 (自发的原生质体融合现象)1.准性生殖过程： 1）菌

26、丝联结； 2）形成异核体； 3）核融合或核配；(10-5-10-7) 4）体细胞交换和单倍体化，形成单倍体杂合子。,准性生殖与有性生殖的比较,1）选择亲本； 2）强制异合； 3）移单菌落； 4）检验稳定性； 5）促进变异。,2.准性杂交育种：,第四节基因工程,一、基因工程定义基因工程（gene engineering）又称遗传工程(genetic engineering)，是指人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需要。 这是一种自觉的、可人为操纵的体外DNA重组技术，是一种可达到超远缘杂交

27、的育种技术，更是一种前景宽广、正在迅速发展的定向育种新技术。,二、基因工程的特点,.目的性：随机有目的.体外性：突变体外重组（切割、拼接）.时效性：慢（生物进化）快.完善性：优劣并存完善的新类型微生物在基因工程中的作用：所有载体几乎全部工具酶用得最多的受体实现作用手段发酵独特供体,三、基因工程的基本操作,一）目的基因的取得：分离，转录，合成二）优良载体的选择：复制子，增殖，确定切口，选择性遗传标记三）目的基因与载体DNA的体外重组：粘性末端，退火，形成双链，成嵌合体四）重组载体导入受体细胞：如转化，感染五）重组受体细胞的筛选和鉴定六）“工程菌”或“工程细胞”的大规模培养,四、基因工程的应用和发

28、展前景,1、工业上：胰岛素、生长激素释放因子（50万头 羊，10L）、干扰素、乙肝疫苗。 2、农业上：固氮基因转移；纤维素、木质素分解酶 基因酵母；抗性植株。 3、医疗上：遗传病治疗。 4、环保上：“超级菌”分解海上石油。（一年几小时）。 5、基础理论研究上：基因结构和表达；肿瘤发生；细胞 分化、发育等。,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退与复壮 衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。具体表现有： 1、原有形态性状变得不典型了；2、生长速度慢、产生的孢子少；3、代谢物生产能力下降；4、致病菌对宿主侵染力的下降；5

29、、对外界不良条件抵抗能力的下降,复壮,狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施； 而广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。,（一）衰退的防止1、控制传代次数2、创造良好的培养条件3、利用不易衰退的细胞传代4、采用有效的菌种保藏方法（二）菌种的复壮1、纯种分离法2、通过宿主体复壮3、淘汰已衰退的个体,二、菌种的保藏,菌种保藏机构菌种保藏原理和方法 1.挑选优良纯种 2.创造适宜休眠的环境条件干燥的首要作用低温的重要作用既要考虑效果又要考虑简便,菌种的保藏的具体方法,