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1、酶活性浓度测定的主要影响因素及控制,酶（enzyme）,酶的应用临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。酶的概念是一种由活细胞产生，具有高度专一性、高度催化活性的特殊蛋白质，又称为生物催化剂。酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者为主。酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。酶活性浓度的测定受许多因素的影响。,酶活性浓度测定的主要影响因素,1. 标本及标本采集和处理因素2. 试剂及方法学因素3. 仪器因素的影响4. 测定条件与参数设置,1.标本及标本采集和处理因素的影响及控制
2、,1.标本及采集和处理的影响因素,1.1 溶血1.2 抗凝剂1.3 温度1.4 空气与光线1.5 标本副反应1.6 酶蛋白浓度1.7 其他,1.1 溶血,最重要的影响是RBC内酶的大量释出。大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性远高于血清；如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高100、15和7倍左右。RBC释放的Hb在300500nm可见光波段能使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的测定。,1.1 Hb的吸光度曲线,1.1 溶血影响的控制,减少溶血体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加以克服；分清体内溶血与体外溶血。减少溶血的干扰可通过设置样品对照，或使用双波长比色、连续监测法以
3、及改进商品试剂等措施，克服对分光光度分析的影响。应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。,1.1 注意: RBC中酶的干扰,不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以，静脉采血后，必须在12h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免引起误差。,1.2 抗凝剂,临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清作为首选测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属离子螯合剂；在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子，Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5-核苷酸酶（
4、5-NA）的激活剂。,1.2 肝素,是一种粘多糖，是对酶活性影响最小的抗凝剂，对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响，适于急诊时迅速分离血浆进行测定。,1.3 温度,由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶（如AST、-GT和ALP等）可在室温保存13天活性不受影响。有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37放置1h，活性可下降50%。,1.3 贮存不同室温体液酶的稳定性（活性变化小于10%）,*酶不耐融化；与同工酶类型有关；标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5,1.3 温度影响的控制,及时检测低温贮存大部分酶在低温中比较稳定，因此当天不能测定时，应在血清分离后置冰箱中
5、冷藏。,1.4 空气与光线,血清置于空气中时，血中CO2丧失极快，pH可在15min内由7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感的ACP活性迅速下降。某些酶易受光线破坏，CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆地失活，其失活程度与暴光时间的长短成正比。,1.5 副反应,副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶测定的反应。 NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶很多是一致的。若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。,1.5 副反应(酶偶联法测ALT),由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血液标本中所含丙酮酸反应，引起34
6、0nm波长处吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。ALT活性测定的反应式如下：,1.5 副反应的控制,可通过加入副反应抑制剂，或对样品进行预处理等方法给予排除。双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗费时间是最经济的方法。,1.6 酶蛋白浓度,酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易解离、易吸附于容器上和易发生表面变性之故。酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超过检测仪器的线性范围时，需将样品进行稀释或减少样品用量后再行测定。样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与抑制剂被稀释有关。,1.7 其他,样本器皿的质地和洁净度，采血部位，以及血清中过量的胆红素、脂质，样品制备过程中的振摇等，均可引起酶活性改变。
7、季节冬季气温低，血液凝固慢，血清分离时间延长，可引起血细胞内酶释至血清，加上血清与空气长时间接触，可使某些抑制剂遭到破坏，故冬季测定LD的活性较夏季高。,2. 试剂及方法学因素的影响及控制,2. 试剂及方法学的影响因素,酶的测定大多使用商品试剂盒不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包括缓冲液、底物、添加剂等）、产品质量、技术含量等常有区别。常见的影响因素2.1 定时法与连续监测法2.2 检测底物或检测产物2.3 底物启动模式与样品启动模式2.4 正向反应与逆向反应2.5 试剂的干扰作用,2. 影响因素的控制,选购试剂盒时要仔细阅读试剂盒说明书；了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等；选择IFC
8、C或中华医学会检验学会推荐的常规方法，或选择公认的测定方法。使用时定期对试剂盒的质量进行监测；准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽；正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。,2. 酶活性测定的原理,酶活性与速度的关系 *酶促反应进程曲线,2.1 定时法与连续监测法的选用,在条件许可的情况下，应尽可能全部采用连续监测法，少用或不用定时法。连续监测法可以选择线性期的反应速度来计算酶活性，测定结果可靠，是首选的方法。但该方法仪器要求相对较高。 在基层单位，某些酶采用定时法测定也可以得到比较准确的结果。ALP酶活性的测定，如加做样品空白，两法的结果准确性相当。,2.
9、1 连续监测法与定时法的酶促反应时间进程曲线,2.2 检测底物或检测产物的选择,取决于哪个更方便，测定的结果更准确。通常原则是选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。反应时底物浓度高，反应时间短；这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物所取代的原因之一。除部分测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外，已很少采用测定底物消耗量的项目。,2.2 检测底物或检测产物的选择,底物与产物举例ALT测定（赖氏法-定时法）L-丙氨酸 + -酮戊二酸 -丙酮酸 + L-谷氨酸-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 2，4-二硝基苯腙 (红棕色，=505nm)ALT测定（连续监测法）L-丙氨酸 + -酮戊二酸 -丙
10、酮酸 + L-谷氨酸,2.3 底物启动模式与样品启动模式,底物启动模式（IFCC推荐采用）。指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时间后，再加入内这种底物的试剂2，开始启动样品中的待测酶的酶促反应。好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。这种模式需要双试剂剂型。样品启动模式。指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应；只是在延滞期去除部分干扰物。这种模式可采用单一试剂剂型。,2.3 底物启动模式与样品启动模式,双试剂与单试剂酶促反应时间进程曲线,2.3 需要注意,某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有将底物单独
11、作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。,2.4 正向反应与逆向反应,一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。除原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向外，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。例如，CK的测定普遍采用逆向反应，因其逆向反应是正向反应的6倍，而且受影响因素少。,2.4 正向反应与逆向反应,LDH测定的选择目前尚有争议。国内多采用正向反应（LP），与IFCC在2001年发表的操作手册一致。正向反应有利于LD1的活性表达，同时试剂成本低廉，稳定性好。国外常用方法曾是逆向反应（PL），反应速度是正向的3倍，成本也较低。,2.5 检测试剂的干扰作用,试剂酶的污染。组织匀
12、浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。底物的非酶反应。很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。如碱性磷酸酶（ALP）测定 解决的方法是通过试剂空白管检出并加以校正。选购IFCC或中华检验学会推荐的方法和质量好的试剂。,3. 仪器因素的影响及控制,3 仪器的影响因素,加样系统加样的准确性、重复性和携带污染；反应系统反应杯的形状、表面和携带污染；反应杯和反应槽温度的准确性、波动范围；搅拌和清洗机构的效果和携带污染；检测系统光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等均会造成结果的偏差。,3 仪器影响因素的控制,在日常工作中，除常规做好仪
13、器和设备的正确使用和维护外，重点应注意仪器的校准问题。,3.1 酶活性浓度的计算公式,摩尔吸光系数 和系数 K 均为常数， 和 K受仪器诸多因素的影响，如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。 和 K 可用校准物定期校正。,3.2 校准物,可用作酶活性测定用的校准物分两类。一类是产物的基准物质，如对硝基酚、对硝基苯胺等，用于校准仪器的 值（摩尔吸光系数）。另一类称酶校准物（Enzyme calibrator），多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近，用于校准仪器的 K 值（酶活性浓度定量系数）。,3.2 校准物,国际上已经有经IFCC认可
14、的CRM酶参考物。各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。,3.3 的校准（340 nm波长）,NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。在340nm的NAD(P)H的，可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的。NAD(P)H的为6220。如果6 0006600为不合格，则需找维修部检查。注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。,3.3 的校准（405 nm波长）,最常用的色素原为对硝基苯酚等。对硝基苯酚在405 nm的，可用ALP
15、测定试剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标准液作为血清标本，实际测定计算值。对硝基苯酚的为18700。如果值偏差过大，则需找维修部检查。,3.4 K的校准（公式计算法）,将上述实测值代入K值计算公式得到校准K值外。,3.4 K的校准（酶校准物）,使用公认的酶校准物对K值进行校准，它是国际上目前酶测定标准化新途径。使用酶校准物的优点，除具有实测值换算出的校准K值所具有的一切优点外，还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。,3.4 K的校准（频率）,最好（低）每半年进行一次酶活性的校准。仪器在使用过程中，滤光片、加样系统的精度都可能发生变化，光学系统的
16、灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等，都会导致测定结果的偏差。但日常工作中，遇到下列情况时，必须进行校准：试剂盒改变厂家，或者更换了批号；仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件；质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。,4. 测定条件与参数设置,4.1 最适条件包括,合适的底物和最适底物浓度；理想的缓冲液种类和最适离子强度；反应液的最适pH；最适反应温度；合适的辅因子、激活剂浓度；若是酶偶联反应，还需要确定指示酶和辅助酶的用量；合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期；合适的样品与反应试剂的比例；足够的检
17、测范围；尽量去除各种抑制剂等。,4.2 反应温度,目前常规实验室越来越多的使用37，这更多地是从实际工作方便来考虑。1986年以前，IFCC推荐酶活性测定的温度是30，纯镓的熔点为29.77，镓作为此温度的基准物质，保证了测定仪器在30的高度准确性。2001年，IFCC正式发表了“37下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统”，包括CK、LD、ALT、AST、GGT五个酶在内。,4.2 反应温度,酶活性与酶促反应温度的关系,4.3 延滞期、线性期的确定,延滞期的确定延滞期可以因酶在样品中所存在的介质不同而略有差别，原因可能是存在内源性干扰物，也可能存在一些抑制剂。确
18、定原则是多观察浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。线性期的确定离不开酶浓度的可测上限，因为酶浓度越高，在同样时间内消耗底物越多，产生产物越多，底物的不足和产物的抑制将导致非线性期的提前到来。,4.3 延滞期、线性期的确定,线性期与非线性度的大小有关，没有绝对意义上的线性期，线性期是以指定的非线性度作为判断基础的。线性期如何确定呢？主要看读数次数和读数间隔来决定，为了计算非线性度，按最小二乘法的计算要求，读数次数应不少于4次，读数间隔按一般仪器要求30秒就足够了，线性期在2分钟以上即可。中华医学会检验学会规定酶活性测定要求线性期不短于2.5分钟。若规定线性期不短于2.5分钟
19、可以测得酶活性的最高浓度就是该法的测定上限。,4.3 延滞期、线性期的确定,单试剂与双试剂酶促反应时间进程曲线,4.4 样品与试剂比例,根据酶活性计算公式不难看出，改变样品与反应液总量的比例就可以改变K值。样品量与反应液总量的比例与方法检测的灵敏度和检测上限有关，与测定误差也有关。按仪器噪音0.001计算，K值不易过大，否则会造成检测误差加大。,4.4 样品与试剂比例,值得注意酶活性的发挥与介质有关，经常发现改变样品与反应液总量的比例，测定结果并不会成正比例地改变，可能与激活剂、抑制剂、酶的解聚和聚合、酶的稳定性等因素有关。因此，样品与反应液总量的比例一旦选定，就不能随意更改。,4.5 自动生
20、物化学分析仪参数的设置,常规参数包括方法类型、波长、样品量与试剂量、稀释水量、反应时间、孵育时间、延迟时间、监测时间、试剂吸光度上、下限、底物耗尽限额、线性度、试剂空白速率、线性范围、计算因子F值（或系数K）等。,小结:保证结果准确可靠的条件,控制好标本采集和保存等实验前影响因素；选择IFCC或中华医学会推荐的方法；按照IFCC推荐法所规定的配制方法生产试剂，并提供酶类校正物；做好室内质量控制，监控试剂质量和仪器性能；实验室的操作人员应控制好测定条件，合理编制分析仪参数；参加各地区组织的酶类室间质评工作，不断提升实验室的比对能力。,小结:作好质量控制，保证检测质量,做好室内质量控制，保证酶类检测结果的精密度；参加室间质量评价，保证酶类检测结果的准确度；检验工作的标准化，是促进检验质量提高的有效措施。,谢谢！,
