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1、第四章 微生物的营养第一节 微生物的营养要求第二节 培养基第三节 菌种分离及保藏技术,第一节 微生物的营养要求,一、碳源 除水分外，需求最大 (占干细胞重50% )。 1.包括：有机碳和无机碳。 2.功能：提供C和能量。 3.优先利用：如葡萄糖效应（葡萄糖、乳糖）。,二、氮源1.功能：提供N和部分能量。2.种类：无机和有机氮。3.优先利用：（NH4）2SO4被认为速效氮源。如龟列链霉菌（产土霉素），利用玉米浆黄豆饼粉和花生饼粉。利用混合氮源，控制菌体生长和产代谢物提高土霉素产量。,三、无机盐大量元素(10-4-10-3moL/L)：P、S、K、Mg、Fe、Na等；微量元素(10-8-10-6m
2、oL/L）：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等，须控制量。功能：酶的激活剂（Mg2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+），维持大分子和细胞结构(Ca,Mg,Fe等)，调节渗透压（Na+）和无氧呼吸氢受体(NO3-,SO42-)等。,四、生长因子（酶的辅酶或辅基）1.种类 维生素（传统生长因子），嘌呤、卟啉、甾醇、脂肪酸等。2.微生物对生长因子的利用（1）能合成全部：占大多数（自养型），过量合成型（链霉菌VB12）。（2）不能或只能部分合成（异养型）须额外添加对应因子；如乳酸菌：添加嘌呤核苷酸；支原体：添加甾醇。,注：菌不同需生长因子的种类和数量不同;同种菌，环境不同需生长因子不同。如鲁氏毛霉：在厌氧需
3、VB1+生物素；好氧自身合成。,五、水1.分为自由水和结合水。2.水活度(aw)微生物可实际利用的环境中自由水的量，或生长环境中水的有效性。一定温度和压力下，溶液蒸汽压与同条件下纯水蒸汽压的比值。,几类微生物生长最适w,aw=P/P0 P为溶液蒸汽压； P0 为纯水蒸汽压 M的aw一般在0.60-0.99之间,六、能量,化学物质（化能营养型）,有机物：化能异养型,无机物：化能自养型,辐射能（光能营养型）：光能自养和光能异养,七、微生物的营养类型 按碳源、能源、氢供体划分。,注：区分是相对的。异养菌：有机物存在可同化CO2 。自养菌也能利用有机物。条件变化营养类型改变，如紫色非硫细菌无有机物：自
4、养 ；有机物存在：为异养；厌氧光照：光能营养；好氧黑暗：化能营养。,第二节 培 养 基,人工配制，适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物所用的营养基质。一、配制培养基的原则二、培养基的类型及应用,一 配制培养基的原则,目的明确 营养协调 条件适宜 经济节约,1.目的明确：目的菌、营养类型、什么用。2.营养协调 浓度合适，比例协调（如C/N）。如水C源N源无机盐生长因子。菌不同，C/N不同，细菌、酵母菌为5/1，霉菌为10/1。同一种菌，生长阶段不同，C/N也不同。如谷氨酸棒杆菌，菌体生长C/N为4/1；谷氨酸积累为3/1。,3.条件适宜渗透压，pH，氧化还原电位和水活度。（1）pH细菌：pH7.
5、0-8.0；放线菌：pH7.58.5；酵母和霉菌：pH4.56.0。,调pH方法,外源调节：1mol/L的NaOH和HCl溶液,内源调节,磷酸缓冲剂（KH2PO4和K2HPO4）：产生少量酸、碱时（pH6.4-7.2内起调节作用）。,碳酸钙：中和培养过程中产生大量酸。,培养基中天然缓冲物质：氨基酸，蛋白质。,（2）氧化-还原电位（）量度还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势。不同微生物要求值不同。好氧：0.3-0.4V提高通气量或加氧化剂；厌氧：+0.1V以下加还原剂（抗坏血酸、Na2S等）；兼性厌氧：+0.1V有氧呼吸，-0.1V发酵。,4.经济节约糖蜜（含蔗糖，制糖工业废液）乳清（含乳糖，乳制
6、品工业废液）麸皮、米糠、豆饼粉、花生饼粉等。5.附-灭菌处理121.3，15-20min或115，35min 。不耐高温物质：先过滤除菌或间歇灭菌混合。长时间高温磷酸盐、碳酸盐+某些阳离子沉淀。加EDTA，或分开灭菌混合。,6.常见的四种培养基培养细菌：牛肉膏蛋白胨培养基，pH7.0-7.2培养放线菌：高氏一号培养基，pH7.2-7.4培养酵母菌：麦芽汁培养基，自然培养霉菌：查氏培养基，PDA培养基，pH自然,二、培养基的类型及应用,（一）按成分来源划分（二）根据物理状态划分（三）按用途划分,（一）按成分来源划分1.天然培养基优点：配制方便、营养多、经济。缺点：成分杂，不稳定，重复性差。例：肉
7、汤、麦芽汁培养基。用途：研究和生产。,2.合成培养基用途：研究。优点：重复性强。缺点：贵、烦琐、生长慢。例：高氏一号、察氏、葡萄糖铵盐培养基等。3.半合成培养基用途：广泛。例：马铃薯-葡萄糖培养基。,（二）根据物理状态划分1.固体培养基（1）固化培养基液体培养基+琼脂（1.5-2%）或明胶（5-12%）。用途：分离、鉴定、活菌计数及保藏。 （2）天然固体培养基（3）非可逆性凝固培养基 血清凝固或用无机硅胶做凝固剂，不能再融化，培养致病菌。 注：凝固剂有琼脂，明胶，硅胶。,2.半固体培养基液体培养基+琼脂（0.2-0.7%），如明胶培养基。用途：观察细菌运动、噬菌体效价、厌氧菌的培养和保藏。3.
8、液体培养基4.脱水培养基 除水分以外，其他已配制好，如虎红培养基（孟加拉红+氯霉素）。,（三）按用途划分1.基础培养基 含所需基本营养物质。2.加富培养基 基础培养基+特殊营养物质(酵母膏,组织液,血液，血清等)。用途：培养苛刻菌，分离富集菌。3.鉴别培养基 基础培养基+指示剂（与微生物代谢产物发生显色反应）鉴别菌。,纤维素水解圈,放线菌,霉菌,4.选择培养基 （1）根据特殊营养要求或理化抗性设计分离菌种。（2）分类 加特殊营养物：如纤维素、蛋白质（氮源）或不加氮源（只加甘露醇）； 加抑制剂青霉素+链霉素（抑制细菌和放线菌，分离真菌）；孟加拉红+链霉素+金霉素（分离真菌）；结晶紫（杀G+，分离
9、G-）；苯酚或重铬酸钾（抑制细菌和真菌生长，低浓度对放线菌无影响）；制霉菌素（抑制霉菌和皮肤癣菌，分离细菌和放线菌）。,5.其他分析培养基：分析化学物质（如抗生素、维生素）的浓度，或微生物的营养要求。还原性培养基：培养厌氧菌。组织培养物培养基：含宿主细胞，培养病毒、衣原体、立克次氏体和某些螺旋体等。,第三节 菌种分离及保藏技术一、纯培养分离技术固体分离技术、液体培养分离、单细胞分离及其选择培养基分离技术四种。注：四种技术相辅相成，互相联系。,（一）、利用固体培养基分离纯培养1.稀释倒平皿法和涂布平板法(10X稀释法，取菌悬液+培养基)2.平板划线分离法 (连续划线,目的是使cell分散) 3.
10、稀释摇管法,涂布平板法,稀释倒平皿法,1.稀释倒平皿法和涂布平板法,注：无菌条件下操作；稀释倒平皿法：温度45-50，长在培养基表面和内部。涂布平板法：长在培养基表面。,2.平板划线法,3.稀释摇管法 分离厌氧菌，稀释倒平板法的变通形式。过程含培养基的试管（50左右）；梯度稀释样品，摇匀冷凝。倒灭菌液体石蜡-固体石蜡混合物，培养。挑单菌落。,（二）、液体培养基分离法挑较大细菌、原生动物和藻类。用液体培养基梯度稀释培养。同一稀释度，若大多数试管没有菌生长（95%）有菌生长的试管纯培养物。,（三）、单细胞分离法显微镜下直接挑取。难度与个体的大小成反比，藻类、原生动物易分离，细菌难分离。（四）、选择
11、培养基分离法1.直接分离：样品中目的菌含量多时。2.加富分离：样品中目的菌含量少。,直接分离,富集分离,无对氨基苯甲酸，不生长,有对氨基苯甲酸，生长,二、菌种保藏技术 根据菌种特性和保藏目的进行保存。1.原则（1）选良种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢）（2）创造休眠环境如低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等。,2.几种常用保藏方法,3.菌种衰退、复壮（1）衰退 自发突变丢失优良生产性状、遗传标记。 原因：基因突变，传代过多。 衰退表现菌落和细胞形态改变； 生长慢，产孢少； 抵抗力减弱；代谢物产量或寄生力下降。, 防衰退方法控制传代次数；用不易衰退的细胞传代（如单核孢子）；选合适培养条件及保
12、藏方法；（2）复壮 狭义复壮:已衰退，找出未衰退个体。 广义复壮:未衰退前，进行纯种分离、生产性能测定提高性能。, 复壮措施纯种分离：平板划线、涂布、单细胞挑取等。接入寄主内复壮；淘汰已衰退的个体（理化条件处理杀死衰退个体）。,4.国内外菌种保藏机构（1）任务：收集、保管不死、不衰、不乱研究、交换和使用。（2）菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,练 习 题,1.名词：生长因子、培养基、鉴别培养基、 选择培养基、水活度、加富培养基、衰退、复壮。2.培养基的配制原则？3.配制培养基时为何调节pH？怎样调节？4.实验室常用来培养细菌、放线菌、霉菌的培养基及pH？5.如何筛选分解CMC的微生物？6.如何利用VB12专一性微生物对样品VB12的含量进行定量分析？7.能否仅凭借水解圈的直径和菌落的直径比来筛选高产胞外酶菌株？为什么？,8.常见的营养类型有哪些？对应的碳源、能源和氢供体各是什么？9.简述EMB培养基鉴别作用的原理。10.如何用富集培养技术分离纯化分解石油的微生物？11.如何判断菌种是否衰退？若衰退，如何复壮？,
