第四章微生物的代谢与调节及其人工控制课件.ppt

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1、江南大学生物工程学院,第四章 微生物的代谢与调节及其人工控制,微生物的代谢,新陈代谢 metabolism The complex of physical and chemical processes occurring within a living cell or organism that are necessary for the maintenance of life. In metabolism some substances are broken down to yield energy for vital processes while other substances, ne

2、cessary for life, are synthesized.,合成代谢anabolism 在合成酶系的催化下，由简单的小分子、能量（ATP）和还原力（H）一起合成复杂的生物的大分子的过程。,分解代谢catabolism 指复杂的有机分子通过分解代谢酶系的催化产生简单分子、能量(ATP)、和还原力（H）的过程。,分解代谢的三个阶段,将大分子的营养物质降解成氨基酸、单糖、脂肪酸等小分子物质。进一步降解成为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸、及能进入TCA循环的中间产物。将第二阶段的产物完全降解生成CO2 ， 并将前面形成的还原力（NADH2）通过呼吸吸链氧化、 同时形成大量的ATP。,微生物代谢的特

3、点：多样性、适应性、可控性,初级代谢和初级代谢产物,初级代谢primary metabolism 微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢产物primary metabolites 包括所有与细胞合成有关的物质 如：氨基酸、核苷酸、乙醇、有机酸、酶,次级代谢和次级代谢产物,次级代谢 secondary metabolism 微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明显确切功能的物质的过程。次级代谢产物secondary metabolites 抗生素、激素、生物碱、色素、维生素等,第一节 微生物的代谢,

4、一、微生物的能量代谢新陈代谢中的核心问题： 能量代谢能量代谢的中心任务：是生物体如何把环境中多种形式的最初能源转换成为对一切生命活动都能使用的通用能源。生物体能量代谢的实质：ATP和酰基辅酶A、酰基磷酸等的生成和利用问题。即ATP的生成和利用的问题。,能源的转化,（一）生物氧化反应,一系列酶在温和条件下按一定次序的催化放能分阶段进行释放的能量部分贮藏在能量载体中,生物氧化与普通氧化反应的区别,生物氧化反应的三个阶段,脱氢：一种失去电子或氢的过程电子供体：被氧化的物质电子受体：接受电子的物质递氢：电子供体氧化脱下的氢交给氢载体，并通过多个载体完成电子从供体到受体的传递不直接交给电子受体受氢：最终

5、电子受体接受载体上电子的过程,（二）电子载体,自由扩散型NAD+和NADP+，氢原子的载体电极对的还原电势相同，功能不同 NAD+/NADH直接参与产能反应NADP+/NADPH主要参与合成反应 与细胞膜紧密结合型 电子传递系统或电子传递链组成：多酶体系，一系列能够进行氧化和还原的载体分布：不对称排列在膜上，定向有序传递,（三）生物能的产生,借助于磷酸化反应ADP形成ATP，实现能量存储,1. 底物水平磷酸化,生物氧化过程中生成的含有高能键的化合物在酶的作用下，直接将能量转给ADP（GDP）生成ATP（GTP）存在于呼吸和发酵过程中发酵过程中唯一能量获取方式,微生物代谢中的底物水平磷酸化,2.

6、 电子传递氧化磷酸化,生物氧化中伴随着电子传递发生的磷酸化作用发生在呼吸作用（有氧或无氧）中呼吸时大多数伴随ATP的合成典型的呼吸链：3分子ATP ， 2分子ATP （黄素蛋白起始）,化学渗透学说(chemiosmotic hypothesis),3. 光合磷酸化,只发生在光合细胞中循环式光合磷酸化：反应产物只有ATP 非循环式光合磷酸化：反应的产物是ATP、氧和NADPH,循环式光合磷酸化,非循环式光合磷酸化,（四）微生物能量代谢的多样性,能源物质的多样性能源物质在微生物中的代谢途径多样性不同环境条件下微生物产能方式的多样性,不同微生物中葡萄糖降解途径的分布,二.化能营养型微生物的能量代谢,

7、（一）能源化合物有机化合物糖类、醇、醛、有机酸、氨基酸、烃类、芳香族化合物葡萄糖：化能有机营养型微生物的主要能源其它单糖代谢转化为糖酵解的中间产物多糖经转化或降解其它非糖有机化合物经转化进入葡萄糖降解途径有机能源化合物代谢的基本途径：葡萄糖降解途径或单糖降解途径,（二）能源化合物的生物氧化生物氧化的形式：某物质与氧结合、脱氢、失去电子生物氧化的过程： 脱氢（或电子），递氢（或电子），受氢（或电子）生物氧化的功能：产能（ATP）、产还原力H、产小分子中间代谢物生物氧化的类型：有氧呼吸、无氧呼吸、发酵,1、有氧呼吸 aerobic respiration,以分子氧作为最终电子受体的生物氧化作用需氧

8、和兼性厌氧微生物在有氧条件下进行有氧呼吸,（1）与磷酸化作用相偶联 C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O +68800卡 （部分转化成ATP）（2）不与磷酸化作用相偶联 C6H12O6 + H2O + O2 C6H12O7 + H2O2 +能量 （不能转化成ATP）,2、无氧呼吸anaerobic respiration,以外源无机氧化物（少数为有机氧化物）作为最终电子受体的生物氧化作用。一些厌氧微生物和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行有无氧呼吸无氧呼吸产生的ATP比有氧呼吸少。,（1）外源电子受体为无机物硝酸盐、硫酸盐、硫、铁、碳酸钙脱氮小球菌的反硝化作用C6H12O6 + 4N

9、O3- 6CO2 + 6H2O +2N2 + 42900卡（2）外源电子受体为有机物延胡索酸、甘氨酸、二甲基亚砜、氧化三甲基胺Escherichia 的延胡索酸呼吸 延胡索酸+2H 琥珀酸,3、发酵作用 fermentation,在没有外源最终电子受体时发生的生物氧化作用叫发酵作用。电子受体为内源性中间代谢产物3-磷酸甘油醛 + Pi + 乙醛 1、3-二磷酸甘油酸 + 乙醇,呼吸作用与发酵作用的比较,相同点： 氧化时，底物上脱下的氢和电子都和相同的载体结合，形成NADH和FADH。不同点： NADH和FADH上的电子和氢的去路不同。 消耗1分子葡萄糖产生的ATP数量不同。,化能营养型微生物的

10、代谢产能方式,三、 葡萄糖分解代谢与工业发酵,葡萄糖 丙酮酸 途径-EMP、HMP、ED、PK丙酮酸 ？产物 进行各种发酵，一般以产物来命名。,无氧条件下,EMP途径,ED途径（单磷酸己糖途径）,HMP途径,TCA循环,PK途径,PPK途径 PHK途径,1.乙醇发酵,酵母菌乙醇发酵EMP途径 C6H12O6+2ADP 2C2H5OH+2ATP+2CO2+2H2O细菌的乙醇发酵(运动发酵单胞菌) ED途径C6H12O6+ADP 2C2H5OH+ATP+2CO2+H2O,酵母酒精发酵,酵母发酵的类型,2. 乳酸发酵,同型乳酸发酵： 发酵产物只有乳酸的发酵称同型乳酸发酵 菌种：德氏乳杆菌、保加利亚乳

11、杆菌、酪乳杆菌 C6H12O6 + 2ADP 2 乳酸 + 2ATP,异型乳酸发酵： 发酵产物中除乳酸外还有乙醇和CO2的发酵 菌种：短乳杆菌、甘露乳杆菌、巴氏乳杆菌 C6H12O6 乳酸 + 乙醇 + CO2,同型乳酸发酵途径,3.混合酸发酵 微生物将葡萄糖转变成琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、氢气、二氧化碳等多种产物的生物学过程。甲基红试验（M.R.反应） 将细菌接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37培养48小时，然后沿管壁加入甲基红指示剂, 呈红色者为阳性, 不呈红色者为阴性。MR反应的结果： 大肠杆菌为阳性，产气杆菌为阴性,4.丁二醇发酵 微生物发酵葡萄糖得到大量的丁二醇与少量的乳酸 、乙酸、

12、二氧化碳、氢气等产物的代谢过程。Voges-Proskauer试验（V.P反应） 将细菌接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，于37培养24小时，加入与培养基等量的VP试剂，置37保温30分钟，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。 VP反应结果 产气杆菌为阳性，大肠杆菌 的为阴性,V.P反应机理,5.丁酸发酵,丙酮酸 乙酰辅酶A 乙酰乙酰辅酶A 乙酸 乙酰辅酶A 丁酰辅酶A 丁酸,6.丙酮丁醇发酵 丙酮丁醇梭状芽孢杆菌 丙酮酸 乙酰辅酶A 乙酰乙酰辅酶A乙酰乙酸丙酮 丙酮酸 丁酸 丁醛 丁醇,7.多元醇发酵 ( 高渗酵母) 葡萄糖,葡萄糖发酵的主要终产物,不同菌种的发酵终产物,三、光能营养型微生物的能量

13、代谢四、还原力的获得五、代谢产物的合成,第二节 微生物的代谢调节,代谢调节：Regulation of metabolism 微生物按照需要改变体内的代谢活动的速度和方向的一种作用。调节方式：酶合成和活性的调节实现代谢途径、代谢流量及速率的调控区域分隔调节细胞透性调节,一. 微生物代谢调节的部位与方式,物质进出细胞胞内的生化反应代谢反应的区域分割及关联,（一）物质进出细胞,（二）胞内的代谢反应,通过酶的生物合成与活性调节而实现对代谢反应的调节！,1、胞内的生物化学反应代谢流向控制代谢速度控制 酶活性和合成量的调节是代谢调节的核心,代谢流向的调控,可逆反应：不同的辅基（辅酶）控制流向谷氨酸脱氢酶

14、： 谷氨酸合成：NADP+ 谷氨酸的分解：NAD+互逆单向反应：不同的酶控制不同方向的反应,2. 代谢反应区域分割及关联 原核微生物细胞膜酶酶与底物相对位置 真核微生物细胞膜与细胞器膜酶酶与底物的相对位置及间隔状况,微生物酶的调节,粗调节：酶合成量的调节，是发生在基因水平上的调节。精细调节：酶活性的调节，调节细胞内已有酶分子的活性，是发生在酶化学水平上的调节。,二、 酶活性调节,以酶分子结构为基础指调节胞内已有酶分子的构象或分子结构来改变酶活性，从而调节所催化的代谢反应的速率特点：作用直接、响应快、可逆,酶活性的调节机制,酶的变构调节 allosteric regulation激活抑制酶的共价

15、修饰 covalent modification of enzyme激活抑制酶蛋白的降解失活能荷调节,Allosteric regulation,激活的调节类型,前体激活在分解代谢途径和合成体系中，处于途径前面的代谢产物促进催化后面反应的酶活性补偿性激活在关联分支合成途径中，从H到I的反应需要E的参与，则H可激活催化合成E的途径中的第一个酶活性,分支途径酶活性的调节类型,能荷 energy charge 对酶活力的调节,巴斯德效应： 在有氧情况下，由于呼吸作用，酒精产量大大下降，糖的消耗速率大幅减慢。,能荷=,ATP+1/2ADP,ATP+ADP+AMP,通氧,ATP,柠檬酸,能荷,异柠檬酸脱

16、氢酶活性,磷酸果糖激酶活性,6磷酸葡萄糖,基团移位吸收葡萄糖速率,三、酶合成的调节,组成酶 constitutive enzyme 是一类对环境不敏感的酶，这类酶在细胞内的合成量相对比较稳定。适应酶 adaptive enzyme 是一类对环境敏感的酶，它们响应环境条件而开始合成或终止合成。诱导酶 inducible enzyme阻遏酶repressible enzyme,操纵子的构造,操纵子的构成,1、诱导 Induction,Gene induction,2、阻遏 repression,Gene repression,分解代谢物阻遏 指细胞内同时有两种分解底物存在时，利用快的那种底物会阻遏

17、利用慢的底物的有关酶合成的现象。末端产物阻遏 指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。,Positive control of the lac operon,cAMP receptor protein,Diauxic growth of E. coli,Negative control of the trp operon,3、阻尼 attenuation,氨基酸生物合成途径中的酶的合成受相应的氨基酰-tRNA浓度的控制当有过量的氨基酰-tRNA存在时，对于已被引发的转录，但在第一个结构基因被转录之前即终止转录。阻遏是对转录启动的控制； 阻尼是对已被引发的转录实现转录终止的控制trp ope

18、ron 受trp-tRNA的阻尼，受trp的阻遏,4、基于rRNA水平的调节,酶的转译受rRNA形成的控制,前体 氨基酸 AA-tRNA 蛋白质 酶 核糖体(rRNA+P),ppGpp,第三节 微生物代谢的人工控制及其应用,微生物代谢的人工控制,代谢的人工控制：人为地打破微生物细胞内代谢的自动调节，使细胞过量积累目的代谢产物。代谢控制发酵：利用生物化学和遗传学的原理，控制培养条件，使微生物代谢朝向人们希望的方向进行，过量积累代谢产物代谢控制育种：通过遗传变异来改变微生物的正常代谢，使某种代谢产物形成和积累,代谢控制育种,目的代谢产物大量累积人为打破自动调节，改变代谢流向减少或切断支路产物的形成

19、提高细胞膜的通透性减少育种的盲目性初级代谢产物生产，成效显著次生代谢产物生产，效果不明显,代谢调控育种的措施,(一）解除目的产物对合成途径的反馈调节-代谢控制育种1、应用营养缺陷型突变株条件解除反馈抑制 营养缺陷型auxotroph： 因某种突变的结果而失去合成某种生长及代谢所需物质（生长因子）的能力的突变菌株。必须在培养基中补加该物质，否则不能生长。,C. glutamicum,高丝氨酸脱氢酶,(AK),例：高丝氨酸营养缺陷型突变株(Hser-)条件解除（Thr+Lys)对AK的协同反馈抑制 Hser-不能合成高丝氨酸，进而不能合成苏氨酸和蛋氨酸，在补给适量的高丝氨酸（或苏氨酸和蛋氨酸）的条

20、件下，可大量积累赖氨酸。Hser-的筛选 野生型菌株诱变CM培养基分离挑选Hser-突变株 CM MM MM+Hser野生型 + + +Hser- + +,2、应用渗漏突变株(leakage mutant)解除反馈抑制例：利用Hserl解除（Thr+Lys)对AK的协同反馈抑制： Hserl细胞能合成Hser，但合成的量仅能维持细胞的最低生长，胞内的浓度达不到进行反馈调节的浓度。筛选： Hser- 诱变 挑选在MM上生长缓慢而且菌落小的回复突变株,3、应用抗反馈调节突变株解除反馈调节 （结构类似物抗性突变株）抗反馈调节突变株：是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼而有之的突

21、变株。结构类似物 analog（抗代谢物antimetabolite） 是一种与初级代谢产物结构类似但缺乏生理功能的化合物。例1：黄色短杆菌AHVr突变株可解除Thr的反馈抑制而积累苏氨酸,Brevibacterium flavum,(AK),Threonine AHV a-Amino-b-hydroxyvaleric acid a-氨基-b-羟戊酸,突变前 突变后 抗反馈抑制突变的机制,抗反馈阻遏突变的机制,Lys AEC S-(2-Aminoethyl)-L-Cysteine,例2：谷氨酸棒杆菌的(Thr+AEC)r突变株可解除（Thr+Lys)对AK的协同反馈抑制而积累Lys,C. gl

22、utamicum,高丝氨酸脱氢酶,(Thr+AEC)r,抗结构类似物突变株(Thr+AEC)r的筛选,将诱变以后的菌悬液涂布在特定的基本培养基上（加入致死量的AEC+Thr)，在此平板上长出的菌落即为(Thr+AEC)r菌株。验证长出的突变株是否真正解除的反馈调节-过量积累Lys。其它可能出现AECr突变的情况细胞膜对AEC透性的改变细胞内出现分解AEC的酶,筛选突变株中常用的几种结构类似物,积累的物质 结构类似物 Arg 刀豆氨酸 Phe 对-氟苯丙氨酸、噻恩基丙氨酸 Trp 5-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸 Val a-氨基丁酸盐 Ile Val Met a-氨基-4-乙硫基丁酸 腺嘌呤 2

23、,6-二氨基嘌呤 尿嘧啶 5-氟尿嘌呤,关于结构类似物抗性突变株的筛选测定致死浓度用相应的氨基酸解除反馈作用抗药性逐渐提高效果好,4、应用营养缺陷型回复突变解除反馈抑制,营养缺陷型的机制之一酶的催化部位发生改变，失去催化活性酶的催化部位和调节部位同时改变营养缺陷型回复突变株的机制催化部位和调节部位同时发生回复突变催化部位回复但调节部位没有回复,野生型 营养缺陷型 回复突变,营养缺陷型回复突变解除反馈抑制,（二）提高细胞对目的产物的通透性,发酵工业上用的菌株对细胞透性的要求 容许营养物质进入细胞 对中间产物的透性不大 目的产物形成后可以尽快透过细胞膜进入环境,1、应用营养缺陷型突变株条件控制细胞膜的透性-代谢控制育种例：C. glutamicum的谷氨酸发酵，细胞膜对产物的通透性不好，从而影响产物的分泌和积累。生物素缺陷型突变株（VH- ） ：添加亚适量的生物素：减弱脂肪酸的合成，提高膜的透性油酸缺陷型突变株：限量添加油酸可提高膜的对谷氨酸的透性,2、控制细胞壁的生物合成，提高细胞对目的产物的透性-代谢控制发酵例：谷氨酸发酵中添加亚致死量的青霉素：部分抑制肽聚糖的合成，造成细胞壁的不完全合成，使细胞对谷氨酸的透性加大。,限量添加只对生长态细胞有效 如：生物素，油酸，青霉素等,（三）添加前体绕过调节点 -代谢控制发酵,通过添加C，可大量积累D,