第四章项目三微生物的生长与控制课件.ppt

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1、1,第四章 微生物的生长与控制,微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映 生长繁殖情况可以作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标 生产实践中的各种应用、对致病微生物和霉腐微生物的防治与其生长繁殖和抑制密切相关,2,本章内容,测定生长繁殖的方法微生物的生长规律影响微生物生长的主要因素微生物培养法有害微生物的控制,3,三 微生物的连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuous culture） ：在微生物培养

2、的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。,4,连续发酵（continuous fermentation）,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利

3、用率低于单批培养。连续发酵生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,5,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）计数法 直接法（血球计数板） 间接法（平板计数法、膜过滤法、比浊法）（二）生长量法 直接法(干重法) 间接法（碳、氮含量法，其它生理指标）,第三节 测定生长繁殖的方法,6,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如真菌孢子、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格

4、线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,1.直接计数法血球计数板,7,2.间接计数法,8,（1）稀释平板计数法,9,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15-20min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,A standard plate count (viable count) reflects the numbe

5、r of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.,10,（2）薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,11,

6、（3）比浊法,原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与吸光度成正比，菌数越多，吸光度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的吸光度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,12,二、生长量法,13,1、干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%-20%，而一个细菌细胞一般重约10-12-10-13g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。

7、,14,2.生理指标法,测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,15,微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用:一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响,另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改变环境.研究环境因素与微生物之间的关系,可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面,

8、同时防止它有害的一面.,第三节 环境因素对微生物的影响,影响微生物生长的外界因素很多，除了前面讲过的营养因素之外，还有许多物理化学条件。本节主要内容：一、温度对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响三、pH值对微生物生长的影响,16,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在：影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。,一、温度对微生物生长的影响,17,从微生物整体来看:生长的温度

9、范围一般在-10 100 极端下限为-30 ，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,（一）微生物生长的三个温度基点,18,1、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。,（三）高温与低温对微生物的影响,19,当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构

10、并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。 当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。,2、低温对微生物的影响,20,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌 好氧菌 微好氧菌 兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌 厌氧菌 (专性)厌氧菌,二、氧气对微生物生长的影响,21,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作

11、为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性厌氧菌（facultative aerobe）,22,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD

12、和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,23,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（ O2 ）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强

13、，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,24,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶,25,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂

14、，降低 培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,26,三、pH值与微生物生长的相互影响,27,微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。不同的微生物最适生长的pH值不同,（二) 不同微生物对pH要求不同,28,一些微生物生长的pH值范围,29,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要，举例：Aspergill

15、us niger(黑曲霉)在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,30,微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。,31,微生物的生命活动对环境pH值的影响,微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因：由于有机物分解：分解糖类、脂肪等

16、，产生酸性物质，使培养液pH值下降；分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升,32,微生物的生命活动对环境pH值的影响,培养过程中调节pH值的措施过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。,配制培养基时调整pH值的措施,33,第五节 微生物生长繁殖的控制,34,几个基本概念,灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。消毒（disinfection）采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。防腐（antis

17、epsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。,35,低温：利用4以下的各种低温以保藏食物、药品、菌种等。缺氧：在密闭容器中加入除氧剂，如铁粉。真空保藏也是比较常用的方法。干燥：采用晒干或红外线干燥保藏粮食、食品等，或在密封条件下用吸湿剂也可达到防霉作用。高渗：通过盐渍或糖渍达到高渗。高酸度：如泡菜、酸菜等。防腐剂：苯甲酸、山梨酸、脱氢醋酸等,防腐的措施,36,1、高温灭菌（消毒）法是最常用的物理方法。高温

18、可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,一、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法,（一）温度,37,干热灭菌法（dry heat sterilization）焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150170 ，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。特点：由于空气

19、传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。,38,湿热法(moist heat sterilization) ：特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因： 1) 菌体内含水量越高，则蛋白质凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强；,39,高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温灭菌的方法。 方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温

20、度例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,40,高 压 蒸 汽 灭 菌 锅,注意事项：排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,41,煮沸消毒法将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。巴斯德消毒法（Pasteurization）：用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒该法一般是将待消毒的液体食品置于62处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。低温长时法(Low temperature

21、 long time,LTLT)；62.930min处理牛奶高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处理牛奶,42,间歇灭菌法： 将待灭菌物品在80-100蒸煮30-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。 缺点是麻烦、费时。,43,采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤

22、膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。但不能除去病毒。实验室中常用的滤器：过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜； 以及石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等。滤器孔径：常用0.22 m 、0.45 m 。应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌。,（二）过滤除菌法,44,（三）辐射,45,1、可见光：波长在400800nm的电磁辐射为可见光。大部分微生物不需要光，少数菌需要光作为能源。一般来讲，可见光对大多数化能微生物没有影响，但是，太强或连续长时间照射也会导致微生物死亡（光氧化作用）。,46,2、紫外线（）波长在100 - 400nm的电磁辐射为紫外线。紫外线

23、杀菌或诱变原理：紫外线作用于DNA ，使其产生胸腺嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡。紫外线会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧释放的原子氧有杀菌作用。其中波长在260 - 280nm处的紫外线杀菌力最强。主要因为核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰为280nm。,紫外线（）,47,使用紫外灯照射，若以面积计算，一般30W的紫外灯可用于15M2的房间消毒，照射时间为20-30min。,48,3.电离辐射：、射线 ，波长短，能量高，有较强的杀伤力。作用原理 ：可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤

24、或死亡。 特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。 应用：用于杀菌或菌种诱变。,49,超声波：每秒钟振动在1600以上的声波。机理：引起膜破坏，细胞破裂，内涵物逸出。 应用：破碎细胞，提取胞内物质（代谢产物、酶等）杀菌,超声波杀菌效力大小与频率、强度、处理时间等多种因素有关。,50,5、渗透压细胞内溶质浓度与胞外溶液的溶质浓度相等时，为等渗溶液,溶液的溶质浓度高于胞内溶质浓度为高渗溶液,溶液的溶质浓度低于胞内溶质浓度为低渗溶液.在等渗溶液中,微生物的活动保持正常,细胞外形不变在高渗溶液中,细胞易失水,脱水后发生质壁分离,生长受抑制或死亡.(盐渍和糖渍保藏食品)在低

25、渗溶液中,细胞吸水膨胀,甚至导致细胞破裂死亡.,51,渗透压与溶质的浓度有关: 溶质浓度高,渗透压大. 对于一般微生物来说，在含盐5%30%或含糖30%80%的高渗条件下可抑制或杀死某些微生物。,7.干燥,52,53,二、化学方法,消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂.主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。,（一）表面消毒剂,54,常用的表面消毒剂及其应用,55,56,57,概念：化学治疗剂是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性的化学药剂，它们与非特异的化学药剂相比对人体几乎没有什么毒性或毒性很小，可用作治疗微生物引起的疾病。种类：

26、 抗代谢药物人工合成的 抗生素微生物所产生的,（二）、化学治疗剂,58,1、抗代谢类药物（生长因子类似物）:,概念：有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以致于可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质叫抗代谢物，用于疾病治疗，称抗代谢类药物，如：磺胺类药物。机理：作为菌细胞基本生长因子的竞争性抑制剂（与相应酶竞争性结合）而阻止微生物对生长因子的利用，因而可以抑制微生物的生长。种类： 磺胺药对氨基本甲酸 ； 6 - 巯基嘌呤嘌呤； 5 - 甲基色氨酸氨基酸； 异烟肼吡哆醇。,59,二氢蝶啶 +对氨基本甲酸 二氢叶酸 四氢叶酸 辅酶F磺胺药 核酸合成,二氢叶酸合

27、成酶,二氢叶酸还原酶,磺胺药作用机理：,细菌需要利用对氨基本甲酸合成生长所需的叶酸：,60,2、抗生素,概念：抗生素：微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制或杀死其它微生物的生长。抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）；窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素）,61,2、抗生素,作用机制：1）抑制细胞壁的合成；（如：青霉素） 2）破坏细胞膜功能；（如：多粘菌素可作用于膜磷脂使膜溶解） 3）抑制蛋白质合成；（如：氯霉素，四环素、链霉素等） 4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、新生霉素、丝

28、裂霉素、灰黄霉素）,62,1.抑制细胞壁合成,TMP,磺胺药,PAPB,细胞膜,多粘菌素短杆菌肽,链霉素卡那霉素 四环素,3.抑制蛋白质合成,红霉素氯霉素,2. 抑制RNA合成,2.抑制DNA解旋酶,诺氟沙星 新生霉素,主要抗生素和化学治疗剂的作用模型,利福霉素利福平,3.抑制蛋白质合成,4. 干扰细胞膜合成,5.抑制细胞代谢,63,微生物的抗药性,抗药性主要通过遗传途径产生，如基因突变、遗传重组或质粒转移等。,1、产生一种能使药物失去活性的酶；2、把药物作用的靶位加以修饰；3、形成“救护途径”；4、使药物不能透过细胞膜；5、通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外。,微生物产生抗药性的原

29、因,如何解决微生物的抗药性问题？,64,在微生物的培养过程中，如果要缩短其生长的延迟期，可以在菌种、培养基和其它方面采取哪些措施? 细菌生长曲线分哪几个时期？各时期有何特征及在工业发酵中的应用。 单细胞微生物的群体生长规律常分为哪四个时期？各有何特点？ 辨析题：分批培养时，细菌首先经历一个适应期，此期间细胞处于代谢活动的低潮，所以细胞数目并不增加。,思考题,65,在微生物培养过程中，引起pH改变的原因有哪些？在实践中如何保证微生物处于较稳定和合适的pH环境中？ 根据下图中五类对氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态，分别写出它们的名称,思考题,66,思考题,抑制细胞壁合成,抑制蛋白质合成,抑制DNA合成,对微生物的作用机制,67,好氧微生物液体培养主要有哪些形式？它们各自有哪些用途和特点？ 消毒和灭菌的概念有何不同？实验室常用消毒和灭菌的方法有那些？分别指出灭菌原理、优缺点、涉及仪器的简述操作步骤及注意事项。,思考题,