第八章 微生物的遗传变异和育种课件.ppt

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1、第八章 微生物的遗传变异和育种,第一节 遗传和变异的物质基础 第二节 基因突变和诱变育种 第三节 基因重组 第四节 基因工程 第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,返回主目录,遗传型又称基因型，指某一生物体所含有的全部遗传因子即基因的总和。 表型- 指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 变异生物体在某种内因或外因的作用下，所引起的遗传物质结构或数量的变化。变异的特点在群体出现的速率极低（10-5-10-10），变化后的新性状可遗传。 饰变不涉及遗传物质结构变化，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,表型饰变：,表型的差异只与环境有关，其特点：暂时性、不

2、可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,第一节 遗传和变异的物质基础一.

3、 3个经典实验1、1944年，Avery精确重复了转化实验， 确定了转化因子,实验证明:将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,第八章微生物的遗传变异和育种,返回目录,2、噬菌体感染实验,实验证明：进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,第八章微生物的遗传变异和育种,3、植物病毒重建实验1956年H.Frankel-conrat用TMV 的RNA和HRV（霍氏车前花叶病毒）RNA进行重组，说明核酸是遗传物质。,第八章微生物的遗传变异和育种,二. 遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 （一）遗传物质在7个水平上的形式 1、细胞水平 （真原） 2、细胞核水平（基因组）

4、 3、染色体水平（单双） 4、核酸水平(种类结构大小) 5、基因水平 （操纵子） 6、密码子水平（三联体） 7、核苷酸水平,第八章微生物的遗传变异和育种,（二）微生物基因组结构的特点,1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短；个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列,第八

5、章微生物的遗传变异和育种,1）典型的真核染色体结构； 啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布 在16条染色体中；2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列； 4）重复序列多；,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,第八章微生物的遗传变异和育种,（三）原核生物的质粒,1、定义 质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进 行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,第八章微生物的遗传变异和育种,2、结构特点通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和R

6、NA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）,第八章微生物的遗传变异和育种,3、质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）,第八章微生物的遗传变异和育种,4、质粒在基因工程中的应用 质粒的优点： （1）体积小，易分离和

7、操作 （2）环状，稳定 （3）独立复制 （4）拷贝数多 （5）存在标记位点，易筛选,E. coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体,第八章微生物的遗传变异和育种,6、质粒的主要种类,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（cryptic plasmid）,第二节基因突变和诱变育种,一. 基因突变生物体内遗传物

8、质的分子结构，突然发生了可遗传的变化。几率10-6-10-9 (一).基因突变 营养缺陷型 基因突变而丧失合成一种或几种生 长因子的能力类型。 选择性突变 抗性突变型 产生对某种药物或物理因子的抗性 类型 条件致死突变型某种条件可生长，另一种条件死 的类型。 形态突变性 个体或菌落形态所发生的非选择变 化的类型。 非选择性突变 抗原突变型指基因突变引起的抗原结构发生 突变的变异类型。（L型细菌）产量突变型 指基因突变而获得的在有用代 谢产物产量上高于原始菌株的突 变株。,(二)突变率10-6-10-9,第八章微生物的遗传变异和育种,返回目录,(三).突变的特点,.不对应性指突变的性状与引起突变

9、的原因间无直接的对应关系。因这一突变有的可自发或其他诱变因子诱发获得。 .自发性 变量实验: 1943年S.E. Luria 等又称波动实验 涂布实验: 1949 Newcombe设计 平板培养法。 平板影印实验: 1952证明微生物的抗药性在未接触 药物前就产生了，这一突变与药物毫无关系：产生28 个突变株。 .稀有性 一般在10-6-10-9 .诱变性 可提高10 10 5 .稳定性 遗传结构发生了稳定性的变化。,4.基因突变的机制,转换 碱基置换 点突变 颠换 移码突变 缺失 诱变 缺失 添加 添加突变 崎变 易位 倒位 自发突变,.独立性 在某一群体中，即可发生抗青霉素，又可发生抗链霉

10、素的突变型。 .可逆性 野生型基因 突变型基因,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明,第八章微生物的遗传变异和育种,1.碱基的置换 碱基的置换属于一种染色体的微小损伤，也称点突变。分为转换（嘌呤换嘌呤，嘧啶换嘧啶）A-G；颠换（嘌呤换嘧啶或）A-T。直接引起置换的诱变剂，直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，如亚硝酸、羟胺、各种烷化剂。 间接引起置换的诱变剂，通过活细胞的代谢活动渗入到DNA分子中后引起的，如嘌呤、嘧啶及5-BU. 2.移码突变指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的添加（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误。吖啶类染料，包括亚啶黄。亚啶橙（

11、诱变机制还不清楚）。,转座因子(transposible element),跳跃基因(jumping gene)在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。,(3)染色体畸变,插入序列(insertion sequence)：分子量小，0.71.4kb，只能引起转座效应而不含其它任何基因。,转座子(Tn, transposon)：分子量为225kb，含有几个到十几个基因。能插到受体DNA分子的许多位点上。,Mu噬菌体(mutator phage)：是E. Coli的一种温和噬菌体，分子量大，约37kb，含20多个基因，可以引起插入突变。,自发突变的机制,1.背景辐射和环境因素 实质

12、上是一些原因不详的低剂量诱变因 素长期综合诱变作用的结果辐射或高温。 2.微生物自身有害代谢物的诱变效应，如 自己产生过氧化氢的作用。 3.互变异构效应酮式至烯醇式的互变效 应引起5-BU。 4.环出效应DNA复制过程中链上产生 小环。,1 损伤机理,2 修复,光复活作用：把近紫外线照射的微生物立即暴露于可见光下，可显著降低其死亡率。暗修复作用：切除修复，有四种酶参与。,5 紫外线对DNA的损伤及修复,二. 突变与育种,1. 自发突变与育种 . 从生产中选育 .定向培育优良品种用某一 特定因素长期处理某些微生物的群体，同时不断的对他们进行移种传代，选择相应的自发突变菌株。传统的方法。卡介苗（结

13、核分支杆菌）的培育，法国科学家A.Calmette 和C.Guerin把牛型结核分支杆菌接种了230代，前后13年，获得了显著减毒的卡介苗。 梯度平板法筛选（P-220） 2. 诱变育种 . 基本环节可以慨括为由少数到高效（P213）,. 诱变育种应考虑的原则：,（1）选择简便有效的诱变剂： 化学诱变剂种类很多（P214），N-甲基- N、硝基-N-亚硝基胍（NTG），诱变效果显著。 NTG处理许多菌种，可得到1280%的营养缺陷型，又称为超诱变剂，而一般的诱变剂处理只得到几%，拟辐射（有些烷化剂既能诱发点突变，又能诱发只有辐射才能诱发的染色体畸变）。任何能改变核酸结构的因素都可能引起核酸生物

14、学功能的改变。三致 “致变(正负) 致畸 致癌”,70 年代发明微生物利用营养物质缺陷的回变检出致癌物艾姆斯试验。艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸缺陷型his-菌株在基本培养基的平板上不能生长，如果发生回复突变则能生长。,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高.,平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂； 有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高； 在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。 该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致 癌物时间3天，准确率85%。,化学诱

15、变方法（较为简单的一种）： 先在平板表面涂一层出发菌株细胞，然后在平板上放几棵很小的诱变颗粒，或含诱变剂的滤纸片，在菌圈的边缘挑取突变菌落，分别制成悬乳液，稀释涂抹接种，最后用影印培养法或逐个检出法选出突变株。物理诱变剂： 紫外线、其它射线。常用的物理诱变方法： 紫外线诱变15w灯，30厘米，时间不短于15秒，不长于10-20分，将5毫升单细胞悬液，放置在6厘米的培养皿中在无盖条件下照射。,（2）挑选优良的出发菌株 最好是经过选育过的自发变异株。 （3）处理单孢子（或单细胞）、均匀悬液 尽管如此还会出现不纯的菌落，称为表型延迟。因为诱变剂只作用于DNA一条连，故某一突变无法反映在当代表型上，对

16、霉菌放线菌处理孢子，对芽孢杆菌处理芽孢。 （4）选用最适剂量 目前采用杀菌率为7075%，甚至3070% （5）充分利用复合处理的协同效应 同一诱变剂的重复使用、两种混合或多种先后使用、同时使用等 （6）利用和创造形态、生理和产量间的相关指标P217。 一般分为初筛和复筛两种方案。,3. 营养缺陷型突变菌株的筛选,.培养基的选择 基本培养基（MM）仅能满足某微生物 野生型营养菌株生长的 最低组分培养。 完全培养基（CM）凡可满足一切营养 缺陷型菌株营养需要的 天然或半合成培养基， 称为完全培养基。 补充培养基（SM）凡只能满足相应营 养缺陷型菌株营养需要 组合培养基，称为补 充培养基。,第三节

17、 基因重组,概念凡把两个不同性状个体内的基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。 注意：重组是分子水平上的，杂交是细胞水平上的概念。杂交包含重组，重组不局限 于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交，准性杂交等及原核生物中的转化、转导结合等都是基因重组在细胞上的反映。,返回目录,一.原核微生物的基因重组,1.转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换把它整合在自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子。这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新遗传性状的现象称为转化或转化作用。 转化在原核微生物中较普遍，如Streptococcus pneumonia

18、e(肺炎双球菌) 。,供体菌裂解游离的DNA片段转入某受体菌细胞内的过程。,感受态受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。现已知感受因子是一种胞外蛋白，处于感受态高峰，群体中呈感受态细胞数也随菌种的不同而不同。,转染如果把噬菌体或其他病毒的DNA抽提出来，让他去感染感受态的宿主细胞并进而产生正常的噬菌体后代，或病毒的后代，这种现象称为转染。 他与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体。中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。,2转导,转导通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后

19、者获的前者部分的遗传性状的现象。获得新遗传性状的受体细胞为转导子。见P227 转导现象在自然界比较普遍很可能是产生一种新基因的方式。 普遍转导通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA 小片段的误包 而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象。 完全缺陷噬菌体极少数噬菌体的衣壳将与噬菌体头部DNA芯子相仿的小段供体菌DNA片段误包入其中。因此形成了一个完全不含噬菌体自生DNA 的假噬菌体。,普遍转导,完全普遍转导在鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）完全普遍转导中，以野生型菌株做供体，营养缺陷型突变株做受体菌P22噬菌体（烈性噬菌体引起）作为转导媒介。 有10-6-108的噬菌体衣壳，误包装了与

20、噬菌体头部DNA相仿的供体DNA片段，形成完全缺陷噬菌体，将供体DNA导入受体。,二.真核微生物的基因重组,1.有性杂交指性细胞间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。凡能产生有性孢子的酵母或霉菌原则上都可应用由于高等动植物杂交育种的方式进行育种。 2.准性杂交是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生组重子。常见在半知菌中。,准性杂交主要过程为：准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌。主要过程： 菌丝连接：它发生在形态上没有区别，但在遗传性上有差别的同一菌种的两个不同

21、菌株的体细胞间，频率很低。 形成异核体：两个体细胞经联合后，使原来的两个单倍体核集中到同一细胞中，形成异核体，异核体能独立生活。 核融合：在异核体中的双核，偶然可以发生核融合，产生双倍体杂合子。10-5-10-7。,(体细胞中的染色体间的交换，也称有丝分裂交换)上述双倍体杂合子遗传性状不稳定，在其进行有丝分裂过程中，少数核内的染色体会发生交换和重组，形成极个别的具有新性状的单倍体杂合子。如果对双倍体杂合子进行紫外线、射线处理就会促进染色体断裂，畸变或导致染色体在两个子代细胞中分裂不均，产生各种不同性状的单倍体杂合子。例灰黄霉素双倍体杂合子图8-38。重点：转化、转导、接合、准性杂交,体细胞交换

22、和单倍体化：,第四节 基因工程,概念：基因水平上的遗传工程。既用人为的方法将所需要的某一 供体生物的遗传物质DNA提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割，把他与作为载体的DNA分子连接起来，染后与载体一起导入某一更易生长的受体细胞中，让外源DNA在其中安家落户，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 1.基因工程的基本操作 图8-39 2.基因工程的应用和发展前景 生产多肽类药物、疫苗中的应用：改造传统工业发酵菌种；动植物特性的基因工程改良：基因工程在环境保护中的应用。,返回目录,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一. 菌种的衰退和复壮 遗传性的变异是绝对的；它的稳定性是相对的。 最易觉察的是菌落和细胞形状的改变；生长速度的减缓，代谢能力的减缓（产量少，孢子少。侵染力下降；抗性减低） 正变体；衰退；复壮（狭义和广义） 1. 衰退防止 减少传代次数：创造良好的培养环境；利用不同类型的细胞（孢子）传代，如菌丝常含几个核或异核体， 易衰退；采取有效的菌种保藏,返回目录,2.菌种的复壮纯种分离：通过宿主体内生长进行复壮；淘汰已衰退的菌种 二.菌种的保藏,菌种保藏 机构 首先挑选典型菌种（原种）：其次创造好环境。 保藏的方法及常用方法,