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1、自身抗体ANA、ENA谱,1,PPT课件,综述 结缔组织疾病（CTD，connective tissue diseases）是一类自身免疫疾病，其特征之一就是患者血液中存在抗抗体（ANA，antinuclear antibodies）。ANA是一群特异性的自身抗体，它们能够结合和破坏细胞内细胞核的特定结构。在正常人群中也可能检测到低滴度的自身抗体，而在CTD患者中会发生ANA滴度的急升。这些抗体不仅与疾病病理过程相关，它们同时还是CTD诊断和治疗的依据。高敏感性和高特异性对于这些抗体的检测是最为重要的。,2,PPT课件,自身抗体的意义,是自身免疫病的标记有助于结缔组织病（CTD）的诊断和鉴别诊
2、断判断疾病的活动性预测疾病的预后,3,PPT课件,抗核抗体(antinuclear antibodies，ANAAs)：,ANA是泛指抗各种细胞核成分的自身抗体，以自身组织成分为靶抗原而出现的相应抗体，是血清中存在的一类和自身组织细胞的细胞核发生反应的自身抗体的总称。,4,PPT课件,ANA分类,根据细胞内靶抗原的理化特性和分布：抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗组蛋白（Histone)抗非组蛋白（抗可溶性核抗原抗体anti-extractable nuclear antigen antibodies,ENA和抗着丝点抗体ACA）抗核仁（Nucleolus）,5,PPT课件,ANA分类,根据
3、细胞内靶抗原的理化特性和分布：抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗组蛋白（Histone)抗非组蛋白（抗可溶性核抗原抗体anti-extractable nuclear antigen antibodies,ENA和抗着丝点抗体ACA）抗核仁（Nucleolus）,6,PPT课件,7,PPT课件,2、ANA的检测方法间接免疫荧光法,用核质丰富的培养细胞Hp-2细胞和灵长类肝冰冻破片作为抗原基质。用荧光显微镜观察ANA荧光着染强度和免疫荧光图形。稀释待检血清可检测ANA效价。,8,PPT课件,ANA的筛选：间接免疫荧光法,9,PPT课件,ANA的筛选：间接免疫荧光法,10,PPT课件,抗核抗体（
4、ANA）,方法间接免疫荧光法结果判断: 滴度1：100为阳性 常见核型5种核型（免疫荧光法）：均质型、膜型、斑点型、核仁型、着丝点型等。 不同核型的临床意义不同,11,PPT课件,ANA根据核荧光的类型分为以下几种类型：周边型（M型）：核周边的荧光增强呈环状。M型的ANA主要有抗双链DNA抗体组成，故高滴度的M型ANA几乎仅见于SLE，因此有助于SLE的诊断。均质型（H型）：整个细胞核呈一片模糊而均匀的荧光。H型的ANA主要有抗脱氧核蛋白抗体组成。高滴度的H型ANA主要见于SLE，而低滴度H型ANA偶可见于药物性狼疮，JRA等其他自身免疫性疾病。斑点型（S型）：核内荧光呈颗粒状。是有抗Sm抗体
5、，抗SSB/La抗体、抗Scl-70抗体等多种抗体组成。因此S型ANA可见于SLE，混合性结缔组织病（MCTD），硬皮病（SSc），干燥综合征（SS），多法性肌炎及皮肌炎（PM或DM）等自身免疫病。,12,PPT课件,ANA的筛选：间接免疫荧光法,13,PPT课件,ANA的筛选：间接免疫荧光法,14,PPT课件,ANA的筛选：间接免疫荧光法,15,PPT课件,ANA的筛选：间接免疫荧光法,16,PPT课件,ANA的筛选：间接免疫荧光法,17,PPT课件,ANA检测的临床意义,18,PPT课件,ANA在各种自身免疫性疾病中的阳性率 自身免疫性疾病 ANA阳性率 系统性红斑狼疮(SLE) 活动期
6、95%-100% 非活动期 80%-100% 药物诱导性红斑狼疮(DLE) 100% 混合结缔组织病 (MCTD) 100% 类风湿性关节炎(RA) 20%-40% 进行性系统性硬化症(PSS) 85%-95% 多发性肌炎及皮肌炎(PM/DM) 30%-50% 干燥综合症(SS) 70%-80% 慢性活动性肝炎(CAH) 30%-40% 溃疡性结肠炎(UC) 26%,19,PPT课件,小 结,我免疫实验室应用现代化工艺进行细胞培养和抗原固定，在整个培养和固定过程中采用了保护抗原的方法，因而具有很高的敏感性，起始稀释度为1：100，稀释因子为3.2，而很多实验室采用的是鼠肝或自己培养的HP-2细
7、胞作为基质，敏感性低，起始稀释度为1：20，稀释因子为2，如果滴度为1：80则提示自身免疫性疾病，而欧蒙公司提供判断标准及临床意义：我室起始1：100，同时做1：1000稀释，根据2者的抗体滴度及强度情况判读。意义1：320，则提示自身免疫疾病,20,PPT课件,小 结,ANA是诊断结缔组织病的重要依据。ANA滴度不一定与疾病活动性相关，正常人、尤其老年人可有低滴度ANA。感染性疾病、肿瘤、药物也可阳性。有资料表明：ANA在健康人群中阳性率为3-15%，而且与患者年龄有关，年龄65岁以上健康人群可达10-37%，健康人群在感染病毒情况下，也可以出现ANA阳性，但这些抗体多为暂时性。,21,PP
8、T课件,免疫印迹技术（最常用）,先将ENA混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后把这些区带转印到硝酸纤维膜上，加入待检血清，最后用酶标抗体使相应的抗原带显色,22,PPT课件,23,PPT课件,抗可溶性核抗原(ENA)抗体检测,抗可溶性核抗原(ENA)抗体：Sm、U1RNP 、SSA、SSB、Scl70、Jo-1、rRNP 、Histones、Ro-52、ACA、PO、PCNA、PM-sc1、Nucleo-som,24,PPT课件,1、（史密斯抗体）抗Sm:是SLE标记抗体，帮助前瞻性和回顾性诊断。对早期、不典型的SLE诊断意义大。经治疗缓解后SLE回顾性诊断。抗Sm抗体是系统性红斑狼疮的
9、特异性抗体，与抗dsDNA抗体一起，是系统性红斑狼疮的诊断指标2、（抗核糖核蛋白体）抗u1 RNP (nRNP) 在多种结缔组织病中存在，高效价的抗u1RNP抗体，且无其它特异性的ANA，是诊断混合结缔 组织病的重要血清学依据，阳性率为95-100，抗体滴度与疾病活动性相关。在30-40的系统性红斑狼疮患者中也可检出抗U1-nRNP抗体，但几乎总伴有抗Sm抗体，尤其有精神神经症状的SLE阳性率较高。,25,PPT课件,3、 抗干燥综合征A（SSA/Ro）抗体、抗干燥综合征B（SSB/La）抗体：抗SSA和抗SSB常见于干燥综合征（Sjogrens Syndrome，SS）也见于SLE ，两者同
10、时出现 与干燥综合征相关性大。抗SS-A抗体与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40-80）、也见于系统性红斑狼疮（30-40）和原发性胆汁性肝硬化（20）中，偶见于慢性活动性肝炎。此外，在100的新生儿红斑狼疮中可出现抗SS-A抗体。该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。 抗SS-B抗体几乎仅见于干燥综合征（40-80）和系统性红斑狼疮（10-20）的女性患者中，男女比例为29:1。在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同时出现。 RO-52 为52KD抗原，原与SSA为同一区带，现把它分为2个区带，分子量不同，抗原量不同，意义反应干燥综合症，SLE
11、等疾病，特异性不强。,26,PPT课件,4、（抗硬皮病-70（Scl-70）抗体）抗ScL-70:几乎仅出现在SSc （进行性系统性硬皮病）患者体内，是SSc的特征抗体. 抗Scl-70抗体见于25-75的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动性而异（Scl=硬化症）。在局限型硬化症中不出现。因出现在硬皮病且其分子量为70000，故名。抗原为碱性非组蛋白，抗Scl-70抗体阳性率为60。在其他结缔组织和非结缔组织病偶有阳性，而正常人均阴性，说明本抗体有较高的特异性，是系统性硬化的标记抗体。 进行性系统性硬化又称硬皮病，或系统性硬化病（SSc）,27,PPT课件,5、抗着丝点抗
12、体（ ACA，Centromere ）：硬皮病中的良性变异型CREST综合征阳性率可达80。抗着丝点抗体在不同疾病中的阳性率分别为：CREST综合征（软组织钙化、雷诺现象、食道功能障碍、指端硬化、毛细血管扩张）为50-80%，局限型PSS为30%，雷诺现象为25%，MCTD为7%，SLE为5%，其他CTD为0。但并非 CREST综合征(Calcinosis, Raynauds phenomena, Esophageal Dysmotility, Telangiectasia)的标记抗体，在干燥综合征，某些慢性肝病中亦可阳性,28,PPT课件,6、（抗合成酶抗体）抗Jo-1：见于多发性肌炎（PM
13、)，抗Jo-1阳性的肌炎患者，伴关节炎、“技工手”、雷诺症、发热、肺间质变等称合成酶抗体综合征。7、（抗组蛋白抗体）histone ：主要见于药物或非药物诱导的红斑狼疮及类风湿性关节炎患者，与多种结缔组织病有关。抗组蛋白抗体可在多种自身免疫性疾病（DIL、SLE、RA、SSc ）中出现，不具诊断特异性 。,29,PPT课件,8、（抗核小体抗体）（AnuA）Nucleo-som：核小体是细胞染色质中的一种成分，它是由DNA和组蛋白以特殊的方式相连而组成，在SLE的诱导和致病中起重要作用 对SLE的早期诊断有重要意义比抗ds-DNA、抗组蛋白抗体更早出现阳性率：50%90%特异性98%,30,PP
14、T课件,9、抗PM-Sc1抗体: 可见于多肌炎/皮肌炎8%，弥散型SSC 3% 50%PM-Sc1抗体阳性见于皮肌炎与硬化症的重叠综合症。,31,PPT课件,10、（抗核糖体抗体）PO：一种自身抗体。对系统性红斑狼疮高度特异，并与另一系统性红斑狼疮特异性抗体(抗Sm抗体)高度相关。,32,PPT课件,11、（增殖性细胞核抗原抗体）PCNA:系统性红斑狼疮特异性抗体。可能与系统性红斑狼疮发生弥散性增殖性肾小球肾炎相关，其靶抗原为DNA聚合酶辅助蛋白，可能在控制细胞周期中起关键作用。,33,PPT课件,12、抗双链DNA抗体临床意义临床意义 对SLE的诊断有较高特异性 滴度与SLE活动相关，可作为
15、病情监测及疗效观察指标 与SLE肾损害有关为系统性红斑狼疮(SLE)血清学特异性抗体， SLE的诊断标准之一。SLE患者中阳性率为30-40%左右。抗体滴度的变化与SLE疾病活动程度相关，可用于SLE疾病活动期判断和药物疗效观察。阳性的病人90%以上处在疾病的活动期。参与SLE发病机理：介导的免疫复合物病-狼疮肾炎 所致的血管炎-典型的喋形红斑 非SLE和正常人抗ds-DNA多为阴性，有时其它结缔组织病患者可为阳性，如 SS、DIL、MCTD，但阳性率低，含量也低，而且此类病人一般是SLE重叠综合征。,34,PPT课件,实验方法如下： 有些抗原在Hep-2细胞表达不高（ssA，Jo-1，dsD
16、NA）因此间接免疫荧光法绝非ssA，Jo-1的最佳检测手段。 Hep-2细胞也不是dsDNA的最佳检测基质.目前实验室使用方法为绿蝇短毛虫为基质。,dsDNA在ANA 表现为（）、在绿蝇短毛虫为基质的检测中为（+），因为1. Hep-2细胞和肝组织中dsDNA的浓度仅为绿蝇短毛虫为基质中dsDNA的十分之一。 2.检测ANA时的起始稀释度为1：100，而用绿蝇短毛虫为基质检测dsDNA时的起始稀释度为1：10。 因此只有高浓度的dsDNA抗体出现时，Hep-2细胞和肝组织中才能同时出现均质荧光模型。,35,PPT课件,36,PPT课件,抗体滴度的解读1灵敏度低特异性强性抗体（Sm dsDNA抗
17、ScL-70等）一旦出现（+），可做出诊断，（）不排除相关疾病。2有些阳性率高的抗体（ss-A ro-52等）特异性较差只有在高浓度时才有意义。3有些抗体对疾病的活动度，诊断，治疗非常重要，可用于疗效观察（ANA,dsDNA）。,37,PPT课件,ANA（-）印迹法靶抗原阳性结果。,方法学不同存在检测的灵敏度和特异性不同。1.ANA采用间接免疫荧光法，Hep-2细胞中含有丰富的纯天然的人细胞核和细胞浆抗原，大约含有100-150种左右，未经任何处理。但有些抗原在Hep-2细胞表达不高（ssA，Jo-1，dsDNA）因此间接免疫荧光法绝非ssA，Jo-1的最佳检测手段。Hep-2细胞也不是dsD
18、NA的最佳检测基质。2.免疫印迹法测抗体。抗原为重组抗原，是纯化了的特异性抗原，因此以此为反应基质时灵敏度和特异性都大大的提高了。（dsDNA，M2）3.抗体产生的时间不同，在血清中的浓度不同都会影响抗体的检出率。（抗核小体抗体） 4.高滴度的抗体出现钩状现象，或同时出现大量非特异性抗体，将特异性的抗体遮蔽造成假阴性。 5.印迹法主要是对已知抗体做确证试验，其次是检测Hep-2细胞低表达抗原的抗体。因此不同试验体系所用的抗原来源不同，抗原呈现的形式不同，反应的条件不同等因素的影响，造成不同方法学之间的结果并不具有可比性，因此为了提高自身抗体的检出率要同时进行间接免疫荧光法和纯化的免疫印迹发进行检测。并且注重结合患者的临床表现综合判断。,38,PPT课件,39,PPT课件,
