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1、荧光定量PCR技术及数据处理分析,项目部,内容概要,荧光定量PCR的原理荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程荧光定量PCR仪生工荧光定量产品选择指南,2,荧光定量PCR原理定义,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析与常规 PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,3,荧光定量PCR原理标记方法,4,SYBR Green I,4,TaqMan Probe,分子信标,SYBR Green I 染料法SYBR Green I,5,SYBR Green I是
2、一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,5,SYBR Green I 染料法作用机理,6,6,SYBR Green I 染料法融解曲线,7,将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT),原始图谱,对数图谱,7,SYBR Green I 染料法融解曲线,8,融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：定量准确,融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：定量不准确,8,Taqman 探针法原理,9,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ，MGB 为不发光的荧光基团探针
3、完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针，R与Q分开，发荧光。,9,Taqman 探针法工作机理,10,热变性,引物和探针与模板退火,延伸反应,探针,报告基团,淬灭基团,探针,DNA聚合酶,引物,R,R,R,R,10,Taqman 探针法PCR体系的建立,引物、探针的设计：探针Tm为68-70, 30 bp, 5不能有G, G可能会淬灭荧光素引物尽量靠近探针, 扩增片段400 bp, 引物Tm为59-60反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度
4、优化退火温度优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM其他与常规PCR相同,11,11,实时荧光定量PCR分类分子信标,12,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成,环,茎,荧光素 淬灭剂,12,实时荧光定量PCR分类分子信标,13,13,几种荧光定量PCR方法的应用比较,14,14,荧光定量PCR原理常用名词概念,扩增曲线荧光阈值Ct值,15,15,荧光定量PCR原理扩增曲线,16,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,16,荧光定量PCR原理荧光阈值,
5、17,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值,Threshold,17,荧光定量PCR原理Ct值,18,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Ct value,18,荧光定量PCR原理Ct值的重现性,19,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终
6、点处产物量不恒定；Ct值极具重现性,19,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,20,理想的PCR反应,XnX0 2n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,20,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,21,非理想的PCR反应,XnX0 （1En）n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,En：扩增效率,21,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,22,在扩增产物达到荧光阈值时,XCtX0 * （1En）CtM （1）,整理方程式（2）：,方程式（1）两边同取对数得：,XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈
7、值设定以后，它是一个常数，定为M,Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2）,Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1En）,22,荧光定量PCR原理Ct值与起始模板量的关系,23,Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Lg of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,23,荧光定量PCR原理荧光定量反应性的确认,24,线性关系、扩增效率确认相关系数（R2）：大于0.98标准曲线斜率：-3 -3.5PCR扩增效率（E）：0.9-1.2检测灵敏度确认3
8、5Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增No template control确认35 Cycles内无引物二聚体产生,24,荧光定量PCR技术的主要应用,定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等,25,25,荧光定量PCR的解析方法,绝对定量解析方法相对定量解析方法,26,26,绝对定量的定义,27,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该
9、扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,27,绝对定量分析几要素,28,一个目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择 SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。实验结果显示 扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。,28,绝对定量质粒标准品的制备,29,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,目的基因,基因组DNA,质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用
10、,29,质粒标准品稀释方法,30,倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v,30,绝对定量实验例毕赤酵母A基因的绝对定量,31,方法：检测毕赤酵母的A基因标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照实验步骤： 提取A DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。,31,绝对定量实验例毕赤酵母A基因的绝对定量,32,32,绝对定量实验例毕赤酵
11、母A基因的绝对定量,33,扩增效率（E）计算 E =10-1/斜率 -1 =10-1/-3.481 -1 =1.983-1 =0.938,标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线,y = -3.481x + 40.123 R2 = 0.9996,相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。,33,绝对定量实验例毕赤酵母A基因的绝对定量,34,未知样品拷贝数的计算,将Ct值带入线性方程：,18.45= -3.481 X +40.123,QuantityUnknown=10 6.226 =1682674 copies,
12、34,相对定量的必要性,35,实际目的基因表达量分析,35,相对定量分析方法,36,比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！,36,相对定量分析几要素,37,一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）一组标准样本（有些分析方法不需要）,37,相对定量分析管家基因筛选,38,管家基因 维持细胞基本代谢活动所
13、必须的基因，如：GAPDH、Actin、18S rRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选,P,P,P,O,38,相对定量分析两种常用的分析方法,39,双标准曲线法2 -Ct法,39,相对定量分析双标曲线法,40,通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。公式：,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,待测样品的校正值,对照样品的校正值,40,相对定量分析双标曲线法,41,优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,实验
14、数据,41,相对定量分析2Ct法,42,假设目标序列与内参序列扩增效率相同：,或,最后用任一待测样本 q 的 XN 除以对照样本（calibrator，cb）的 XN 得到：,对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：,XT 是目标基因达到设定的阈值时的分子数RT是内参基因达到设定的阈值时的分子数,42,相对定量分析2Ct法,43,公式：,F =,2,优点：无需作标准曲线缺点： 假定扩增效率为 100 %； 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优
15、化较为复杂。应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,43,相对定量分析2Ct法,44,实验数据：,2 - Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%,Ct（处理前）15132 Ct（处理后）1820=2 Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）224 比率（处理后/处理前）2Ct2（4） 16 所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的16倍,修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么2Ct可以修正为：ECt，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95Ct,44,荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项,45,样
16、品制备,定量体系配备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器介绍,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,45,荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项,46,样品制备,环境要求,定量体系配备,数据分析,RT,上机,浓度确定,46,荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项,47,样品制备,试剂选择,定量体系配备,数据分析,RT,上机,反应体系优化,47,荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项,48,样品制备,误差控制,定量体系配备,数据分析,RT,上机,浓度确定,引物设计,环境要求,48,荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项,49,样品制备,定量体系配备,数据分析,RT,上机,反应体系优化,反应条件优化,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,49,荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项,50,样品制备,定量体系配备,数据分析,RT,上机,技能要求,误差控制,仪器介绍,试剂选择,50,荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项,51,样品制备,定量体系配备,数据分析,RT,上机,仪器介绍,分析方法,51,
