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1、沙皇遗骸的辨认,1917年，十月革命后，尼古拉二世被流放到西伯利亚的叶卡捷琳堡。1918年7月17日清晨全家被枪杀（至少9人）。80年代后，俄罗斯总统叶利钦亲自参加了在圣彼得堡举行的安葬仪式。,第七章 线粒体DNA多态性mitochondrial DNA of polymorphisms,第一节 概述第二节mtDNA多态性第三节mtDNA分型命名第四节mtDNA分型技术第五节mtDNA分型的特殊问题,教学内容和要求,掌握：mtDNA多态性、 mtDNA分型技术 了解：mtDNA分型命名 mtDNA分型的特殊问题,第一节 概述(summary),1.线粒体（mitochondrion）:细胞器，
2、氧化磷酸化和提供能量的场所。2.线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）:细胞核外DNA，编码蛋白质和RNA的基因，人体不同组织细胞所含有的线粒体数目及DNA拷贝数不同，在数百至数万之间变化。,DNA分布,（核染色体是DNA的主要 载体）97.5%,2.5%,第一节 概述,线粒体电镜照片,线粒体“能量工厂”,线粒体是核外唯一含有遗传效应物质的细胞器。,线粒体是真核细胞内的重要细胞器，它是细胞的能量工厂，细胞产生能量的95%来自线粒体中进行的氧化磷酸化。除了红细胞外，人类所有体细胞都含有线粒体，其中多数细胞含有数以万计的线粒体。,由于缺乏组蛋白的保护，线粒体亦缺乏DNA损伤
3、修复系统，mtDNA的突变率较高。,1.mtDNA的结构特征(The structural characteristics of mtDNA),线粒体是细胞质中独立的细胞器，也是动物细胞核外唯一的含有DNA的细胞器。,1981年，剑桥大学的Anderson小组测定了人mtDNA的完整DNA序列，称为“剑桥序列”。,一.mtDNA的结构和功能(Structure and function of mtDNA),人mtDNA是一个长为16,569 bp的双链闭合环状分子，外环含G较多，称重链(H链)，内环含C较多，称轻链(L链)。 mtDNA双链闭合环状在降解检材中不易被核酸外切酶影响，在法医检材中
4、能保持mtDNA完整性。,1.双链16569bp，其中一条为重连，一条为轻连。基因编码物各不相同。2.基因中不含非编码序列。3.几乎不含终止密码。4.转录与翻译均在线粒体中进行。6.DNA不与组蛋白结合。7.部分密码子不同于核基因组密码子。,线粒体结构特征(The structural characteristics of mtDNA),1.mtDNA的功能特点（The functional characteristics of mtDNA）（1）碱基结构紧凑、简洁：以最少碱基数编码尽量多的蛋白质和RNA；基 因间无间隔序列，基因内无内含子、前导序列、带帽序列和终止信 号； 相邻基因甚至有碱基
5、的重叠。 （2）不存在同源基因间的重组与交换。（3）母系遗传，mtDNA所有序列变异呈单倍型特性。,精细胞,卵细胞,遗传密码与一般的通用密码不同,密码子 核DNA mtDNA,UGA 终止 色氨酸 AGA, AGG 精氨酸 终止 AAA 赖氨酸 天冬酰胺 AUA 异亮氨酸 蛋氨酸 甲硫酰胺 AUG AUA起始甲硫酰胺 AUG AUG AUA AUUAUC,2.mtDNA功能：（1）储存信息-编码参与氧化磷酸化的蛋白质和RNA的 H 链：2个rRNA，14个tRNA，12个蛋白质 L 链：8个rRNA，1个蛋白质（2）自身复制-单向复制:置换环复制或D-环(D-loop)复制 特点：不对称的复制
6、 H链和L链各有一个复制起点，先复制H链， H链复制到达L链起始点后，L链开始复制 D-环：新合成第三条H链姊妹链 ，序列与L链互补 H链复制起点附近（ 520-700 ），高变异。（3）转录功能-两条链同时转录合成RNA-对称转录,mtDNA与核常染色体DNA的比较,二. mtDNA,1.母系遗传：直接从母亲传递给孩子。2.高拷贝数和异质性在一个细胞中具有数百到数万个拷贝。当两种不同的mtDNA序列存在同一个细胞、组织或者个体时，称为异质性3.复制分离和瓶颈效应卵细胞有10万份mtDNA的拷贝，能够进入下一代的只有很少（1到数个）-瓶颈效应。mtDNA自主复制，不依赖核染色体而将复制后的DN
7、A分配到子细胞中去。在一个个体内，突变mtDNA的比例可以在细胞分裂的组织中进行的mtDNA复制而发生改变，随着时间推移，将导致表现型的变化。-复制分离,二. mtDNA,4.阈值效应对于发生异质性的mtDNA突变，细胞可以承受正常mtDNA的减少直至达到一定阈值，将会发生细胞死亡或细胞功能受到损坏。5.半自主的细胞器自身含有遗传表达系统（自主性），但编码的遗传信息十分有限，其RNA的转录、蛋白质翻译等功能发挥必需依赖核DNA编码的遗传信息。,第二节 mtDNA多态性,主要集中在mtDNA的非编码区（D环）和部分编码区。其中D环含有两个高变区（high variable regions,HVR
8、）I和II,无修复系统，不受选择的影响，积累了较多的变异，多态性很好，适用于法医学研究。,mtDNA突变率比较高 高 变 区 HVR-I 29 408号碱基 HVR-II 15996 16401号碱基 HVR-III 438 574号碱基 主要原因 A : mtDNA没有组蛋白的保护 B : DNA聚合酶缺乏3-5外切酶校正功能 C : 缺乏DNA损伤的修复体系 D : mtDNA极少或不受来自选择压力的影响 突变类型 碱基的错配-序列多态性 主要为转换（90%）：嘧啶转换 HV-I 80% HV-II 20% 少数是顛换（10%）： CA 或 AC 插入或缺失-长度多态性 polyC：nt1
9、6184-nt16193 ( HV-I ) CA 重复：nt514-nt523 ( HV-III ),一.mtDNA多态性的类型（The polymorphism of mtDNA type）,1.点突变的多态性DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。2.序列多态性DNA排列顺序发生改变：缺失、重复、插入所致。高变区（highly variable region ）内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中的相对位置。,Anderson剑桥序列,1981年Anderson等人完
10、成最初的剑桥序列，1999年再次分析序列更正了最初序列，确定了11处错误。现在以修正序列为准。 整个线粒体基因组应是16568bp，法医学中应用的高变区的序列涵盖了nt16024-nt16365和nt73-nt340。,1.序列多态性（Sequence polymorphism） 主要集中在D-loop区。HV1：nt16024nt16365，342bp。 HV2：nt73nt340，268bpHV3：nt438nt574，137bp2.长度多态性（Length polymorphism）nt514-nt523：CA重复 C-stretch: polyC,mtDNA在法医学上常用的位点,Hea
11、vy (H) strand,Light (L) strand,Coding Region,二.mtDNA单核苷酸多态性 (mtDNA single nucleotide polymorphism, mtDNA SNP),1.概念一个种族不同个体的基因组或共同序列之间，存在单个核苷酸的差异。 在人群中，单核苷酸多态性一般有两个等位基因，在不同的民族、地区中，同一个等位基因的频率有高有低。 线粒体DNA序列中有1122个碱基是非编码序列，在编码区55个碱基不参与编码蛋白。,二.mtDNA单核苷酸多态性 (mtDNA single nucleotide polymorphism, mtDNA SNP
12、),2.序列多态性（Sequence polymorphism） 主要集中在D-loop区。HV1：nt16024nt16365，342bp。 HV2：nt73nt340，268bpHV3：nt438nt574，137bp,三.mtDNA串联重复序列多态性( mtDNA short tandem repeats,STR),集中在D-loop区,核心序列一般在10bp以下，常见的是CA重复（nt514-nt523）和 polyC （nt568-nt573和nt303-nt309）.,三.mtDNA串联重复序列多态性( mtDNA short tandem repeats,STR),由于有多态性重
13、复序列的存在，实际人类mtDNA的长度不总是16569bp,可能会有10bp左右的增减。,四.mtDNA单倍群（mtDNA haplogroup）,线粒体单倍群或单倍型类群是一组类似的单倍型（haplotype），它们有一个共同的单核苷酸多态性祖先。单倍群由相似的单倍型组成，可以从单倍型来预测单倍群。而单核苷酸多态性分析被用来确认单倍型。单倍群以字母来标记，并且以数字和一些字母来补充。 单倍群用来揭示数千年前的祖先来源。 追溯母系遗传的人类起源。,序列多态性（Sequence polymorphism） 主要集中在D-loop区。-HVRI,HVRII,1122个碱基HV1：nt16024nt
14、16365，342bp。 HV2：nt73nt340，268bp长度多态性（Length polymorphism）nt514-nt523：CA重复 C-stretch: polyC,第四节 mtDNA多态性分析技术,第四节 mtDNA多态性分析技术,长度多态性：AMP-FLP分析技术序列多态性：PCR-RFLP法PCR-SSO杂交法PCRDNA自动测序 目前分析mtDNA多态性最常用，也是最准确的方法。,四.mtDNA的PCR-RFLP分型,形成mtDNA序列多态性主要是点突变，在HV-I和HV-II区段，具有变异的碱基位置有700800个，其中大约有2/3的碱基变异涉及到限制酶识别点回文式
15、序列的改变，构成典型的RFLP现象。,四.mtDNA的PCR-RFLP分型,在mtDNA 控制区D环，有88个突变点，其中只有21个能采用PCR-RFLP分析进行分型。 检测mtDNA上多个多态性位点的序列，可以形成多个单倍型（haplogroups）组合，个人识别力比单个位点的明显提高。,五.法医学应用（Forensic application）,PCR-RFLP 技术的优点1.分型技术简单，结果判定容易。2.电泳后不需测定片段长度，避免了测量误差，可以准确判定基因型。3.分型结果稳定，重复性好，分析结果可以用数字化的形式记录保存。4.特异性好，灵敏度高，对检材质量要求低。,一.法医mtDN
16、A分型（Forensic mtDNA typing）,什么时候需要做mtDNA分析？ 当细胞核DNA量不足无法进行核DNA分型时， mtDNA分析技术是唯一可以利用的技术。人体生物检材中的毛发、骨头、牙齿以及其它严重降解的生物检材均可进行mtDNA分析。,二.PCR循环测序-mtDNA序列多态性流程,1.样本mtDNA模板的制备,2.PCR扩增HV1和HV2区域,3.正、反向引物对HV1和HV2区域进行序列测定,4.对比正反向序列确定mtDNA序列,5.与Anderson序列对比找出不同碱基,6.确定该样本mtDNA 的单体型,1.样本mtDNA提取,生物样本：缺乏毛囊的毛干暴露在空气的陈旧的
17、骨骼、牙齿核DNA检测失败的血痕、拭子、组织严重降解的生物检材,2.人类线粒体基因组DNA高变区分析,分析和。1.第一次扩增用L15926-H00580引物扩增D环区片段（1.3kb)。2.第二次扩增用L15997-H16401引物和L00029-H00408引物分别扩增HVR和HVR片段。3.测序模板扩增 双链DNA测序经过L链和H链分别从两个方向测序，对比两链相应碱基的互补性，可以获得准确的序列。4.测序 用自动荧光检测完成。,清洗毛干,溶解细胞,保护DNA分子，防止酶切,纯化DNA,存储DNA,提取毛干中的DNA的步骤,二氧化硅悬浮液的制备,骨粉的制备,除菌，防止外源性DNA的污染,原理
18、：对骨骼进行清洗、消毒、磨为粉末，然后对骨细胞进行裂解，采用吸附和超滤作用对DNA提取和纯化。,骨细胞脱钙,除去杂物，纯化DNA,从gui珠洗脱DNA,3.人类线粒体基因组STR位点分析,位于D环中nt514-523位点处有CA重复。扩增片段长度多态性分析技术检测。,法医学实践中如何根据mtDNA序列多态性进行个体识别或亲子鉴定？,第五节 mtDNA分析在法医学上的应用,优势局限性结果解释,一.mtDNA的特点及其法医学应用优势,1.唯一的核外DNA来源可检测样品范围增大，为很少或没有nDNA（nucleic DNA）的样本的检验提供了希望。如骨骼、指甲、毛干等。2.拷贝数多适于微量、高度降解
19、样本。3.母系遗传可选择的比对参照样本范围扩大。如遗骸的个人认定或一个失踪的人无法提供参考样本，可用其母亲、兄弟姐妹等血液作为参考样本。,二.mtDNA序列分析用于下列情况,脱落毛发指甲、骨骼、牙齿极微量血痕核DNA分型失败样本,案例1 Holland等（1993年）对1984年越南归还的越战身亡美国士兵的残骸成功地进行了身源鉴定。这些残骸遗存于自然环境下长达24年之久。案例2 沙皇遗骸的辨认（1918年埋葬，1991年挖掘，1994年测定mtDNA序列）案例3 （1996年美国）现场仅从死者身上发现1根毛发。mtDNA序列分析与犯罪嫌疑人 Paul Ware 的完全匹配，Paul Ware
20、被判强奸、谋杀罪。这是mtDNA序列分析首次在法庭上作为证据。,Identifying the Romanov Remains (the Last Russian Czar),三. mtDNA分型在法医学应用的局限性,1.分型技术要求高，耗时耗力耗钱（Expensive） FBI： 2003年计划$4,000,000再次资助4个区域性的法医mtDNA实验室； 一年约须2/3的人力分析大约120 mtDNA 的案件。（FBI laboratory 2002 annual report）,三. mtDNA分型在法医学应用的局限性,2.个人识别力相对较低（1）US Caucasians mtDNA
21、database： 1175 个个体检出982种单倍型。（2）中国mtDNA database：检出356种单倍型。（3）非洲裔美洲人mtDNA database：检出1655种单倍型（最多）。（4）巴勒斯坦的mtDNA database：检出8种单倍型（最少）。,三. mtDNA分型在法医学应用的局限性,3.不存在严格的匹配概念，不能作为绝对个人认定的遗传标记。真正价值在于排除统一性。4.异质性5.高污染风险6.混合斑（几乎不可能）,异质性（Heteroplasmy ）,概念 ：一个个体的线粒体DNA有两套或两套以上不同碱基序列差异的情况。 三种形式： a: 个体的不同组织中含有一种以上的m
22、tDNA序列 B:同一个体同一组织的不同细胞的mtDNA序列不同 C:同一个体同一组织的不同细胞同一细胞间不同拷贝的线粒体间有不同序列。 在同一细胞中只有一个拷贝核染色体，但约有100000个拷贝的线粒体DNA，所以一个细胞内的mtDNA比例大于一定值时，才能被检测到其遗传突变（异质性）。异质性出现频率：2-8 % 为避免可能存在异质性影响序列必须双向测序和至少重复一次。,四.mtDNA结果解释可分为三类：,1.排除：排除来自同一个人或家系。 比对样品有2个或2个以上的碱基序列不同。2.不确定 比对样品有1个碱基序列不同。 - 异质性 -不能确定,四.mtDNA结果解释可分为三类：,3.不能排除，匹配 比对样品碱基序列相同 -可能来自嫌疑人 -可能来自与嫌疑人同一母系的人 -可能来自与嫌疑人无母系关系的一个个体考虑案件限定范围，可有认定意义。,谢 谢 !,Thank you!,
