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1、第八章 外源化学物致癌作用chemical carcinogenesis,卫生毒理学教研室2004.5,1775年英国Pott 阴囊癌1895年德国Rehn 职业性膀胱癌1915年日本山极和市川 试验性皮肤癌1922年英国Kennway 动物皮肤癌1945年英国Case 职业性膀胱癌,肿瘤指有分裂潜能的细胞受致癌因素的作用后发生恶性转化和克隆性增生所形成的新生物，在人体任何部位、任何组织都可以发生肿瘤。化学致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程。化学致癌物(chemical carcinogen)是指具有化学致癌作用的化
2、学物质。,第一节 化学致癌机制第二节 化学致癌物的分类 第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,第一节 化学致癌机制,一、化学致癌作用多因素、多基因参与的多阶段过程致癌过程有多个与癌肿有关的基因参与不同器官来源、不同组织类型、临床阶段以至同一种肿瘤在不同地区所见的遗传变化是不同的多种环境致癌物、致癌因子或条件可协同作用个体的不同遗传背景对肿瘤的发生发展有重要影响,二、与致癌作用有关的代谢活化与灭活： 前致癌物 近致癌物 终致癌物 Precarcinogens proximate carcinogens ultimate carcinogens,第一节 化学致癌机制,三、化学致癌作用的分子机制：
3、（一）DNA加合物：（二）DNA修复与致癌过程：（三）癌基因、原癌基因和抑癌基因： 1、癌基因（oncogene）和原癌基因（proto-oncogene）： 2、抑癌基因（anti-oncogene）（四）基因表达调控异常与肿瘤的发生：,第一节 化学致癌机制,四、化学致癌过程：引发阶段 促长阶段 进展阶段（initiation） （promotion）（progression）,第一节 化学致癌机制,第一节 化学致癌机制,第二节 化学致癌物的分类,IARC将化学物对人类致癌性资料(流行病学调查和病例报告)和对实验动物致癌性资料分为四级（2002，878）：组1，对人类是致癌物。对人类致癌性证
4、据充分者属于本组。87组2，对人类是很可能或可能致癌物。又分为两组，即组2A和组2B。 组2A，对人类很可能(probably)是致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。63 组2B，对人类是可能(possible)致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或指对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。234组3，现有的证据不能对人类致癌性进行分类。493组4，对人类可能是非致癌物。1,根据致癌机制分类 1.genotoxic carcinogens直接致癌物间接致癌物无机致癌物2.non- genotoxic carcinogens促长剂 激素调控
5、剂细胞毒剂 过氧化物酶体增殖剂免疫抑制剂 固态物质3.未分类：美舍吡伦,第二节 化学致癌物的分类,一、用于致癌物筛选的短期试验（一）致突变试验：基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验);染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验;原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb/c 3T3细胞。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,一、用于致癌物筛选的短期试验：（二）哺乳动物短期致癌试验： 哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有
6、限(数月)，靶器官有限。较受重视的短期致癌试验有下列四种：1小鼠皮肤肿瘤诱发试验：于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。2小鼠肺瘤诱发试验：染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计)b检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为乌拉坦，促长剂为二丁基经基甲苯(BHT)。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,3大鼠肝转化灶诱发试验。对大鼠
7、进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在814周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有-谷氨酰转肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。4雌性大鼠乳腺癌诱发试验，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，实验周期为6个月。 此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,一、
8、用于致癌物筛选的短期试验：（二）哺乳动物短期致癌试验：何时应考虑进行致癌性评价：人体可能长期暴露于该化学物；该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。如在3种遗传毒理学短期试验均得到阳性结果，可预测为遗传毒性致癌物；如在3种遗传毒理学短期试验均得到阴性结果，可预测为非遗传毒性非致癌物；如经5种遗传毒理学短期试验仍不能预测其致癌性的化学品，应优先进行哺乳动物致癌试验。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,ICH(1995)根据已知的危险因素、拟定的适应症和用药时间，提出下列进行新药致癌性研究的范围，避免不必要的试验。临床上连续应用6个月以上的
9、药品；对慢性或复发性疾病需间断性长期反复治疗的药品；造成长期暴露的给药系统。已知属于对人具有潜在致癌性的同类化合物；构效关系提示具有致癌危险性的物质3长期毒性试验发现癌前病变3原型或代谢产物在组织内长期蓄积，引起局部组织反应或其他病理生理反应的物质。具有遗传毒性的物质往往具有致癌性，如拟长期使用，应进行慢性毒性试验(1年)，检测早期致癌反应。拟用于病人预期寿命少于3年的药品不必进行致癌试验，如肿瘤治疗药等。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,局部使用吸收很差的药物不必进行经口致癌试验。 已具有致癌性资料的药物的各种酸、碱、盐应提供其在药物动力学、药效学或安全性方面没有明显改变的证据，对于
10、酯和复杂的衍生物在确定是否需要进行致癌试验时也应有类似的资料，并应个案讨论。 基本作为替代治疗的内源性物质不需要进行致癌试验。但对生物技术制品，下列情况可考虑进行致癌试验：生物学作用明显不同于天然相应物质的制品；结构明显不同于天然相应物质的制品；在人体引起局部或全身浓度明显增加的制品。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,二、哺乳动物长期致癌试验：（一）试验动物 物种和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。啮齿类动物对多数致癌物易感性较高，寿命相对较短，费用也较低，生理和病理学资料较完备，因此使用最广泛。在选择品系时应选择较敏感、
11、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。 性别：为接近人类情况，应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。年龄：使用刚断乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。,（二）剂量选择和动物数量 致癌试验一般设三个试验组。美国NCI推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量。最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。ICH(1995)提出，高剂量选择可以根据：毒性终点，即最大耐受剂量(MTD);药代动力学终点，啮齿动物血浆AUC(时量曲线下面积)为人的25倍；
12、选择吸收饱和剂量;药效学终点，不应产生生理学和内稳态紊乱;最大可行剂量，受试物在饲料中最高含量为5。限制剂量为1500mg(kg体重d)。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,（二）剂量选择和动物数量中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1/2或1/3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10。中剂量组介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相
13、近。动物数量：每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,（三）染毒途径 经口染毒是将受试物给予实验动物的常用途径，一般把受试物掺人饲料或饮水中连续给予动物(57天/周)。若掺入后的适口性不良，可用灌胃法。掺入浓度要定期监测，观察其均匀性和稳定性，掺入的浓度一般不超过5。经皮染毒，涂敷受试物的面积一般不少于动物体表总面积的10。必须保证受试物与皮肤良好接触，并防止动物舔食。每天涂抹一次，每周37次。吸入染毒，每天染毒4小时，每周57天。染毒柜内受试物浓度应定期或连续监测，其分布应
14、均匀、恒定。其他注射途径可根据需要采用。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,（四）试验期限 ICH(1997)建议参考下面几条准则：(1)一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。(2)当最低剂量组或对照组存活的动物只有25时，也可以结束试验，对于有明显性别差异的试验，则试验结束的时间对不同的性别应有所不同，在某种情况下因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。 一个合格的阴性对照试验应符合下列标准：因自溶、同类自食，或因管理问题所造成的动物损失在任何一组
15、都不能高于10。小鼠和仓鼠在18个月，大鼠在24个月时各组存活的动物不能少于50。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,（五）观察和结果分析 1一般观察 每天观察受试动物一次，主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次。经饲料或饮水给以受试物时，应记录食物消耗量或饮水量，以计算受试物的摄入量。观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。老年动物多病易死，应加强巡视，防止动物死亡后未及时刻验，发生尸体组织自溶。 2病理检查 动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉眼和组织切片检查。组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查
16、有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,（五）观察和结果分析3结果分析 统计各种肿瘤的数量(包括良性和恶性肿瘤)及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。肿瘤发生率()(实验结束时患肿瘤动物总数/有效动物总数)100 式中，有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。肿瘤潜伏期即从摄入受试物起到发现肿瘤的时间，因为内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。应对试验结果进行仔细的统计学分析，并研究剂量反应关系。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,致癌试验阳性的判定标准W
17、HO(1969)：(1)对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加；(2)试验组发生对照组没有的肿瘤类型；(3)试验组肿瘤发生早于对照组；(4)与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。 在进行试验的两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,结果报告：应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应；应报告剂量反应关系及统计学分析结果。如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进
18、展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍希望分别对良性和恶性肿瘤分别进行统计学处理。评价该试验不同剂量良性肿瘤和恶性肿瘤的相对数量可有助于确定该受试动物对受试物的剂量反应关系。另一方面，如果仅观察到良性肿瘤，并无恶性化进展的证据，则将此受试物认为是致癌物是不适宜的，此仅提示在该试验条件下需要进一步研究。,三、人群流行病学观察：（一）接触标记 （二）生物效应标记 （三）敏感性标记,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,四、转基因小鼠在致癌作用的研究 1转癌基因小鼠。与转录启动子连接的癌基因转入后可直接在某些特定的组织中高效表达，使
19、该组织细胞处于引发状态，这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。携带癌基因的转基因动物可用于致癌试验，试验周期仅3个月左右，有希望发展成代替长期动物致癌试验的试验系统。这些携带有癌基因的转基因动物，可用来研究外源化学物与肿瘤相关基因的作用及外源化学物在致癌不同阶段中的作用机制。以各种组织特异性的促长剂处理转入不同癌基因的小鼠，可为致癌过程的研究提供新线索。,四、转基因小鼠在致癌作用的研究：2肿瘤抑制基因敲除小鼠。在P53-/-小鼠，肿瘤(特别是淋巴肉瘤)的发生比正常小鼠(P53+/+)增加而且提前。由于P53-/-小鼠的肿瘤发生具有组织特异性，进一步研究这些肿瘤的遗传学基础有助于鉴定P5
20、3基因的功能。而半合子小鼠(P53+/-)在出生后6个月内自发癌发生率低，但在之后发生淋巴瘤和软组织肉瘤，其中大部分丢失P53野生型等位基因。这种小鼠对遗传毒性致癌物敏感性并不增加。这种半合子小鼠也可用于鉴定致癌过程中的协作基因。而且缺P53小鼠加速形成恶性肿瘤，提示此基因主要在进展阶段起作用。P53在肿瘤发生中的作用有待进一步研究。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,四、转基因小鼠在致癌作用的研究：3转穿梭质粒的转基因动物小鼠：转入带有报告基因的穿梭载体，是研究体内基因突变的转基因动物模型。常用的靶基因如lacI、lacZ可通过噬菌体体外包装等方法，从小鼠基因组内回收，再在大肠杆菌内检
21、测靶基因突变，可为研究不同器官基因的自发突变和诱发突变的分子机制提供有效的方法 。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,第九章 发育毒性与致畸作用,卫生毒理学教研室2004.5,基本概念致畸作用的毒理学特点致畸作用机理外源化学物发育毒性的评价,第一节发育毒性及其评定,第二节发育毒性及其评定,基本概念,发育毒性(developmental toxicity) 指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用。具体表现可分为: 生长迟缓:即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。 致畸作用:由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官
22、表现形态结构异常。 功能不全或异常:即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。 胚胎或胎仔致死作用 :某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。,发育毒性及其评定,畸形、畸胎和致畸物 畸形(malformation):器官形态的异常。 畸胎(terate):具有畸形的胚胎或胎仔。 致畸物或致畸原(teratogen):凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。 致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。,发育毒性及其评定,基本概念,胚胎毒性作用(embryotoxicity
23、) 外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。母体毒性作用(maternaltoxicity) 母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。,发育毒性及其评定,基本概念,母体毒性作用与致畸作用关系具有致畸作用，但无母体毒性出现。出现致畸作用的同时也表现母体毒性。不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。,发育毒性及其评定,基本概念,畸形与变异在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。机体的
24、形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。,发育毒性及其评定,基本概念,致畸作用的毒理学特点,器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感剂量与效应关系较为复杂剂量效应关系复杂的表现及原因致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭致畸作用最大无作用剂量问题尚有不同意见,发育毒性及其评定,物种差异以及个体差异在致畸作用中较为明显在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。,发育毒性及其评定,致畸作用的毒理学特点,致畸作用机理,Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括突变
25、、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。,发育毒性及其评定,干扰基因表达基因突变与染色体畸变损伤细胞和分子水平的翻译细胞调亡干扰细胞通过胎盘毒性引起发育毒性干扰母体稳态内分泌干扰作用,发育毒性及其评定,致畸作用机理,外源化学物发育毒性的评价,传统常规致畸试验动物选择剂量分组动物交配处理胎仔检查,发育毒性及其评定,动物选择: 致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动
26、物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。,外源化学物发育毒性的评价,发育毒性及其评定,剂量分组 一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。 一般最高剂量不超过LD50的1/51/3，低剂量可为1100130。,外源化学物发育毒性的评价,发育毒
27、性及其评定,动物交配处理 每组动物大鼠或小鼠为1220只，家兔812只，狗等大动物34只。 将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。 由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。,外源化学物发育毒性的评价,发育毒性及其评定,胎仔检查 自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。,外源化学物发育毒性的评价,发育毒性及其评定,下列几方面进行畸形检查：外
28、观畸形肉眼检查，例如露脑；肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。,外源化学物发育毒性的评价,发育毒性及其评定,结果评定活产幼仔平均畸形出现数:即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。 畸形出现率:即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。 母体畸胎出现率 :即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。,发育毒性及其评定,外源化学物发育毒性的评价,确定受试物是否具有致畸作用时需注意以下几点：任何结果必须通过统计计算方法进行剂量组与对照组对比；必须具有统计学意义才能认为是阳性结果。 应该掌握所用实验动物品系的自然畸形发生率。致畸作用中动物物种和品系差异较为显著，因此要求在两种动物进行试验。由于物种差异，对动物不具有致畸作用的外源化学物对人是否致畸的问题，应格外认真对待。,外源化学物发育毒性的评价,发育毒性及其评定,发育毒性的替代试验 大鼠全胚胎培养 胚胎细胞微团培养小鼠胚胎干细胞试验发育毒性的体内预筛试验(C .K.试验),发育毒性及其评定,外源化学物发育毒性的评价,问 题,1、致畸作用的毒理学特点是什么？2、发育毒性的评定指标是什么？,
