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1、PCR实验室常用设备、试剂和耗材使用管理,广西临床检验中心 周微雅2012.05.15,常用仪器设备,试剂准备区加样器洁净工作台低温冰箱标本制备区生物安全柜高速( 冷冻)离心机漩涡振荡混旋器恒温水浴箱（金属浴）加样器冰箱扩增区（产物扩增及分析区）PCR热循环仪（DNA扩增仪）,冰箱,1、现在使用的冰箱的温度是否标示范围内？2、需要每天都记录温度吗？,冰箱,冰箱,温度计,1、新购买的温度计准确吗？2、需要做质检吗？3、如何做质检？,温度计,温度计,天平,一、分类1、超微量电子分析天平 2-5g2、微量电子分析天平 20-50g3、准微量电子分析天平 20-100g4、常量电子分析天平 100-2
2、00g5、精密电子分析天平,天平,天平,精密电子分析天平,天平,二、影响重现性的因素1、潮湿2、静电：最好用100%的玻璃容器。3、空气浮力4、温度5、气流和通风6、磁场和磁性样品7、天平放置状态,天平,三、维护1、避免振动。2、在密闭容器内称量挥发性和腐蚀性物品。3、定时清洁。4、避免移动仪器。5、及时检修，不可带“病”工作。6、不可过载，损坏天平。,加样器,放置地点： 试剂准备区 标本制备区 标识： 所在区域 校准状态,加样器-类型,单道连续可调式移液器多通道连续可调式移液器单道连续移液器单道移液管配合使用的移液器,加样器-使用,加样器-型号和取液范围,型号所用量程范围（L） GILSON
3、 eppendorfP10 0.5 -10 0.5 -10 P20 2 -20 2 -20P100 20 -100 10 -100P200 20 -200 20 -200P1000 200 -1000 100 -1000,加样器-技术指标,型号容量 准确度（标准误差） 精度（重复性）2 (L) 绝对误差(L) 相对误差(%) 标准误差(L） 相对离差(%)P2 最小 0.2 0.024 12 0.012 6 0.5 0.025 5 0.012 2.50 最大 2 0.030 1.5 0.014 0.70P10 最小 1 0.025 2.5 0.012 1.25 5 0.075 1.5 0.03
4、0 0.60 最大 10 0.10 1 0.040 0.40P20 最小 2 0.1 5.0 0.03 1.50 5 0.1 2.0 0.04 0.80 10 0.1 1.0 0.05 0.50 最大 20 0.2 1.0 0.06 0.30P100 最小 20 0.35 1.8 0.10 0.5 50 0.4 0.8 0.12 0.24 最大 100 0.8 0.8 0.15 0.15,加样器-使用,加样器-使用,加样器-使用,吸液前进式倒退式,加样器-使用,把按钮压至第一停点垂直握持 加样器，使吸嘴浸入液样中， 浸入液体深度视型号而定：P2和P10 1mmP20和P100 2-3mmP20
5、0和P1000 2-4mmP5000 3-6mmP10ML 5-7mm,加样器-使用,放液将吸头口贴到容器内壁并保持1040倾斜，缓慢平稳地把按钮压到第1停点，等1s后将吸头压至第二点排出剩余液体，压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴管壁擦过，松开按钮，按吸头弹射器去除吸头。,加样器-使用注意事项,根据所需取液量选择 相应的移液器及吸头， 基因扩增实验要求使 用带滤芯的吸头，防 止交叉污染。吸取液体时应缓慢匀速吸取，避免液体溅到移液器头上；打出液体后拇指应缓慢松开按钮，避免液体回吸。在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。连续可调式移液器不可在无吸头时使用
6、，吸头有液体时不可平放或倒置。,加样器-使用注意事项,操作时要慢和稳，吸嘴浸入液体 深度要合适，吸液过程深度尽量保持不变改吸不同液体、样品或试剂前更换新吸嘴发现吸嘴内有残液时必须更换；新吸嘴使用前应先质检。为防止液体进入移液器套筒内，注意以下几点：压放按钮时保持平稳；移液器不得倒转；使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。,加样器-使用注意事项,连续可调式移液器在取样加样过 程中应注意移液嘴不能触及其他 物品，以免被污染；移液嘴盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。连续可调式移液器在使用完毕后应置于以液器架上，远离潮
7、湿及腐蚀性物质。在取液之前，所取液体应在室温（15-25C）平衡；液体温度与室温有异时，将吸嘴预洗多次再用；移液温度不得超过70。不可把容量计数调超其适用范围。,加样不准确的原因,用大量程的移液器移取小体积的液体装配吸头时气密性不好，吸头不匹配吸取的液体具有强挥发性液体的密度与水有明显差异吸液速度和放液速度太快,加样器-维护及校准,维护1一般维护可用中性洗涤剂（如洗餐具用的洗涤灵），或者用异丙醇清洁。然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。2如果有液体进入加样器内的严重污染，可以将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书（不同的加样器的拆开方
8、式有所不同）。3高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒（121及1巴压力下消毒20分钟），（如Eppendor的Research单道可调加样器）。但消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变型。4各区（试剂准备、样本提取、扩增和产物检测）的加样器应有各自的标识，清洁和消毒 时，应分别处理。,加样器-校准,校准方式 计量局 厂家 自校时间 视使用频率定(6个月-1年）,加样器-校准,型号 P1000 出厂编号 L26069L 发证日期 2002-7-4 本移液器已按照国际ISO标准，以吉尔森原厂零配件进行维修及校准， 达到吉尔森产品说明书规定的性能指标，并自发证日起免费担保六个月 （易损零
9、配件不包括在内）。 测定次数 4 次低点校准 设定值 200 ul 平均容积 198.6 ul 绝对误差 - 1.4 Ul 相对误差 -0.7 % 标准离差 0.101 ul 相对离差 0.202 %高点校准 设定值 1000 ul 平均容积 999.37 ul 绝对误差 - 0.63 Ul 相对误差 -0.063 % 标准离差 0.783 ul 相对离差 0.078 %更换部件 O型密封圈测试环境: 温度 25 C 湿度 38 %测试液体： 蒸馏水测试用吸嘴：吉尔森Diamond标准盒装吸嘴,离心机,离心机放置： 水平坚固的地板或平台上，以免离心时造成机器震动打开电源开关，按要求装上所需的转
10、头，将预先平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。,高速（冷冻）离心机,离心机-注意事项,外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线开机前应检查转头安装是否牢固，机腔有无异物掉入更换转头或清洁转头时，应注意安装牢固。样品应预先平衡。离心机运行时，离心机周围30cm范围内不能有人和危险物品。挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离
11、心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。,离心机-注意事项,易燃易爆以及易与其他物质发生反应的物质不能离心。在没有相应的防护措施时，不能离心有毒的、放射性的物质或病原微生物。离心机运行时不可人为地打开盖子。如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹，则应立即停止使用。使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力并大小合适。非金属转头不可用紫外照射。如果被离心的物品密度大于说明书的规定范围，应计算相对离心力。,对于高致病性病原微生物，必须要高度警惕离心过程中产生的气溶胶风险。大型离心机上应加装负压罩，以及时吸出离心机排出的气体，并排至实验室的过滤通风系统，在BSL-3及以上级别实验室尤其要注意。
12、所有的离心管必须带盖密封，其开启应在安全柜内进行。微型离心机则可放在安全柜内离心，但要注意其对安全柜气流的影响。如果不能在安全柜内离心也无负压罩，则必须将密封的转头在安全柜内打开。,1. 所有离心机应处于正常工作状态/合格机械性能，根据厂家说明书进行操作。2. 离心机位于适宜位置和高度，工作人员能看见离心桶，便于进行各项操作。3. 离心管和标本容器根据厂家要求选用，最好使用塑料制品，使用前应检查有无破损。必须在安全柜内打开盖子。4. 使用转头时应注意转头盖与转头型号是否匹配。离心桶的装载、平衡、密封和打开必须在生物安全柜内进行。空离心桶配平时应该用蒸馏水或70乙醇、异丙醇，不应使用盐水和次氯酸
13、盐溶液。离心管内液面水平距管口应留出一定空隙，以确保离心过程中液体不会溢出，尤其是使用角转头时更要注意。（密封的离心桶/安全杯）5. 应该每天检查在特定的转速下，离心杯的内表面有无污物。离心转头和离心桶应每天检查有无腐蚀点以及极细的裂缝，以确保安全。离心桶、转头和离心机腔每次用后都应该消毒。每次用后，应该把离心桶倒放，以排净离心配平的液体。,离心机-维护和清洁,清洁方法：中性洗涤液清洁，然后用清水清洁。必要时使用含0.5%有效氯的消毒液擦拭污染部位，然后用清水擦洗。擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。使用消毒液处理时，温度不可超过25，时间不可超过规定范围。可以用高压消毒的转头，
14、应在清洗后，121 消毒20分钟，转头务必平放，并不受挤压，以免变形。,生物安全柜,防止操作过程中含有危害性或未知性生物气溶胶散逸的空气净化安全装置。保护人、环境、样本,不同型号生物安全柜（BSC）特征比较,安装上要求有一特殊管道通到室外、有一道活性炭过滤器、防爆的发动机及其它电路组成。级柜如果操作挥发性化学物，则不能将废气排到室内。化学浓度不能超过最低爆炸浓度。,生物安全柜,II级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型，是有前窗操作口的安全柜，操作都可以通过前窗口在安全柜内进行操作，对操作过程中的人员、产品及环境进行保护。,二级A1型生物安全柜气流模式,70循环，30外排，操作口气流速度 75f
15、t/min。,二级A2型(原B3型)生物安全柜气流模式,70循环，30外排，操作口气流速度100ft/min，可管道排气。,二级B1型生物安全柜气流模式,30循环，70外排，操作口气流速度100ft/min，可管道排气。,二级B2型生物安全柜气流模式,无循环，100外排，操作口气流速度100ft/min，外接管道。,安全柜的安装,1、有充分清洁与维护空间2、最佳安全柜摆设地点取决于安全柜所受到的外在气流干扰减到最小3、避免高人流量通道4、远离空调排气口，排气扇 根据 ANSI/NSF49:2002 和英国标准BS5726:1992推荐安装指南(安全柜的安装需要由经过培训的专业人员进行),安 装
16、 地 点,地点1：远离周围的气流扰动因素，是推荐的最佳安装地点。地点2：太靠近门、走道以及空调出风口，影响安全柜的气流。地点3：空调出风口会影响安全柜的气流。地点4：太靠近门，侧面太靠近墙壁。地点5：如果相邻的回风口气流不影响安全柜的气流。那5的位置也适合安装安全柜。,实验室屋顶高度要求,比安全柜顶部至少高出100mm,生物安全柜使用原则,充分了解生物安全柜的性能，掌握正确的使用方法。应遵循以下使用原则：缓慢移动原则 物品平行摆放原则 避免震动原则 不同样品柜内移动原则 避免明火使用原则 定期进行安全柜防护效果的评估,生物安全柜的使用规范,每次使用前检查不打开观察窗列出工作所需物品的清单，以减
17、少双臂进入破坏气流 打开风机5-10min窗式报警器、气流报警器任何造成安全柜内气流紊乱的不良操作都会危及操作者的安全,操作准备,生物安全柜内感染性材料溢洒的处理,当发生少量溢洒时，应用吸收纸巾立即处理，并立即用浸满消毒液的毛巾或纱布对生物安全柜及其内部的所以物品进行擦洗。工作面消毒后应更换手套，不论是摘下手套还是更换手套都要洗手。若发生大量溢洒，液体会通过生物安全柜前面或后面的格栅流到下面去，生物安全柜内所有的物品都应该进行表面消毒并拿出生物安全柜，在确保生物安全柜的排水阀被关闭后，可将消毒液倒在工作台面上，使液体通过格栅流到排水盘上。所有接触溢出物品的材料都要进行消毒和/或高压灭菌处理。,
18、生物安全柜污染的清除（1）, 在每次使用前清除生物安全柜内表面的污染，工作台面和内壁要用消毒剂进行擦拭（杀灭任何微生物），但不包括送风滤器的扩散板； 在实验结束时，包括仪器在内的生物安全柜里的所有物品应清除表面污染后，才能移出安全柜； 在实验结束后，应擦拭生物安全柜的工作台面、四周以及玻璃的内外侧等部位以清除表面的污染。 在对目标生物体有效时，可以采用漂白剂溶液或70%酒精来消毒。在使用如漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还必须用无菌水再次进行擦拭。,标本溢漏或泼洒后，立即清除污染物及污染的表面。在生物安全柜维护、更换过滤器、以及性能测试或重新安置之前，必须消毒。最普通的气体消毒方法：甲醛熏蒸推荐将安全
19、柜一直维持运行状态。如果要关闭的话，则应在关机前运行5min以净化内部的气体。,生物安全柜污染的清除（2）,PCR仪,普通PCR仪实时荧光PCR仪PCR-ELISA提取-扩增检测封闭系统,实时PCR仪的发展历史,1993年第一篇文章发表 BIOTECHNOLOGY1996 罗氏的LightCycler注册1997年 ABI Prism 7700,第一个高通量的实时荧光PCR仪1999年 Bio-Rad iCycler2000年 更多质优价廉的仪器 进入市场，通量更高。,PCR仪-检测原理,Taqman荧光探针,PCR仪-扩增原理,变温金属块作恒温装置加热方式：电热发热、半导体发热制冷方式：半导
20、体制冷和压缩机制冷等多种方式。国外产品的特点是产品质量和性能较稳定。机型：适用，建议 8*12孔的模式。空气驱动循环恒温装置本系统力求降低部件的成本，用空气作为热传导媒介。装置包括机箱（外壳）、热源、冷空气源、控制器和辅助电器元件等部分。优点：不用金属的精密加工，成本降低。整个系统没有液体流动，不用致冷液，因而安全程度高。恒温精度可达1 。缺点：单纯靠外部空气制冷，受环境温度影响。,PCR仪-使用,PCR仪应放在临床基因扩增实验室的第三区。仪器应放置水平台上，电源电压须与仪器要求电压相一致，并连接可靠的地线。仪器远离水源、明火及腐蚀性物质。工作室温要求：15-25 ，通风保证散热。配备不间断或
21、稳压电源。尤其是半导体变温设备。每次实验时，最好能将扩增仪内的孔位全部放置样品管，若样品管少时可用空管代替，以保证实验的一致性和重复性。,PCR仪-使用注意事项,基线及阈值 基线范围：基线是背景曲线的一段，基线范围一般从零点调整取110 或115 个循环的荧光信号。 阈值的设定：刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现Ct值为准。,PCR仪-使用注意事项,影响测定结果的因素阈值设定光路维护加样的准确性和反应体系的均一性反应管中是否有气泡反应管不符合荧光检测要求或疏水性差反应管或反应槽被荧光物质污染,PCR仪-清洁和维护,实验结束后应及时擦干孔内的水分，盖上机盖。应定期
22、校准 扩增温度 光路定期清洁热盖和反应孔 95%乙醇或异丙醇,LightCycler (Roche),PCR仪-清洁和维护,一般清洁用不掉毛的布蘸上去离子水擦拭仪器的表面（包括热循环室和样本架的周围）。如果发生了试剂泼洒，用70%的异丙醇溶液或其它可接受的PCR实验室清洁剂来清洗。在清洁仪器前要关闭电源，拔下电源插头。仪器的可移动部分（如K试管盘架和K试管载盘）用不掉毛的布并蘸上异丙醇溶液或其它可接受的PCR实验室清洁剂来清洗。经常检查分析仪的周围，以确保良好的通风环境。检查周围的书本、纸张或其它物品是否挡住仪器的通风。如果样本或其它有生物危害的物质泼洒到仪器或架子上，用中性消毒液擦拭，然后再
23、用95%酒精或异丙醇擦拭。,LightCycler (Roche),PCR仪-清洁和维护,注意事项商品化的家用漂白粉溶液通常含有5.25%的次氯酸钠，对它进行1：10的稀释，就得到0.5%次氯酸钠溶液。！不要使用其它有机溶液（如汽油，苯或其它），因为它们会损害塑料物质。！不能使用浓度超过10%的漂白粉溶液，因为它能腐蚀金属部件。,LightCycler (Roche),临床PCR试剂盒的选用,PCR或RT-PCR试剂盒的组成,核酸提取试剂核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）,PCR反应混合物,Mg2+,
24、Mn2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq DNA 多 聚 酶,rTth DNA 多 聚 酶,AmpErase,生 物 素 标 记 的 引 物,和 或 和,影响PCR试剂盒质量的因素,内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计外在因素：试剂盒的运输和贮存,影响PCR试剂盒质量的因素,内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计,影响PCR试剂盒质量的因素：,扩增所需的原材料寡核苷酸引物和探针缓冲液和dNTP聚合酶、逆转录酶等,寡核苷酸引物和探针,纯度。纯度的判断可根据260/280吸光度比值来判断，如2.0，则需重新纯化。另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的
25、带或迁移位置错误，则需重新纯化。污染特异性（浓度）,dNTP和缓冲液,dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度缓冲液：在储存和扩增循环中稳定、作为聚合酶活性所必须的Mg（或用于rTth的Mn）的浓度以及pH等,逆转录酶、DNA聚合酶,酶的浓度酶的活性,核酸扩增方法,PCRRTPCR转录依赖的扩增（TMA）连接酶链反应（LCR）链替代扩增（SDA）等,影响PCR试剂盒质量的因素：,核酸提取核酸提取的有效性核酸提取的简便性,影响PCR试剂盒质量的因素： 产物检测,杂交固相特异探针及其标记物,试剂盒的运输和贮存,PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是指在适当的贮
26、存温度下。核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20下；产物检测部分试剂则贮存于28。试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运输及运输中的贮存，任一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。,PCR试剂盒的分类,定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交（杂交梳）、荧光PCR（分子信标和Taq Man等）定量测定： PCR-ELISA 、Taq Man和Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。,PCR试剂盒的选用原则,参考试剂生产厂家的信息广告参考同行对有关试剂盒的使用效果参考有关机构的综合评价根据使用目的根据所在实验室的技术特点根据所在医院患者的承受能力,PCR
27、试剂及耗材质检,PCR试剂盒的质检,外包装：厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等。内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。,PCR试剂盒的质检(定性测定),性能质检采用血清（样本）盘（Panel）质检： PCR试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、阳性样本、23份纯化核酸（DNA或RNA或cDNA）样本以及35份系列稀释阳性样本所组成。样本总数可定在20份左右。 原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限。,试剂特异性、
28、灵敏度和符合率计 算 公 式,试剂特异性、灵敏度和符合率计 算 公 式,灵敏度（） (a/a+c)100%特异性（） (d/d+b) 100%符合率（） (a+d/a+b+c+d) 100%,PCR试剂盒的质检(定量测定),样本：已知浓度的高、中、低三种浓度质控物。质检内容：测定的重复性 测定范围 抗干扰能力,PCR耗材质检,带滤芯吸头的质检密封性：制备一个含1%-2%甘油及色素的水溶液（甲基橙、红墨水、蓝墨水），如最大体积为100ul，则将加样器吸取体积调到110-120ul后，套上吸头吸取上述有色液体。如吸头质量好，有色液体不应出现在滤芯之上，否则说明滤芯不严。,离心管的质检,PCR抑制物
29、：从新购的离心管中，抽取6-10支，采用已知的高、中、低3 个浓度的HBV DNA样本，使用抽取的离心管按程序进行检测，每一浓度双管重复，同时使用已知无PCR抑制物的离心管作为对照，如结果与预期或对照管明显偏低，（如1-2个数量级），则证明有抑制物存在。,离心管的质检,密封性：从新购的离心管中，抽取6-10支，加入一定量的液体，（如500ul的水），在100条件下10分钟，观察是否有暴管现象。抽取6-10支，加入一定量的液体，高速离心，观察离心管是否的破管。,谢谢大家！,人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。,
