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1、429572439gao,课题3,酵母细胞的固定化,429572439gao,甜,一、课题背景,高果糖浆 高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，不会对人的健康造成大的伤害。,1. 直接使用酶制剂,天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活。,溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本。,反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用,（1）优点,（2）缺点,催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。,1. 直接使用酶制剂,（3）解决方案,固定化酶技术,2. 固
2、定化酶,（1）含义：,将酶固定在一定空间内的技术，如固定在不溶于水的载体上。,（2）实例：,利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。,将固定好的酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。 将葡萄糖溶液从反应柱上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与葡萄糖异构酶接触，转化为果糖，从反应柱下端流出。,2. 固定化酶,（3）优点：,酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。,（4）缺点：,一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。,（5）解决方案：,固定化细胞
3、技术,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。,3. 固定化细胞,（1）含义：,将细胞固定在一定空间内的技术。,（2）优点：,成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收。,（3）缺点：,固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。,二、酶和细胞固定化方法,1. 固定化酶或固定化细胞：,指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。,2. 方法：,将酶（或细胞）包埋在细微网格里,将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。,将酶（或细胞）吸附在载体表面上,包埋法,
4、化学结合法,物理吸附法,固定化酶或固定化细胞采取的方法,【比较】酶和细胞的固定方法和特点,酶分子很小，容易从包埋材料中漏出。,细胞体积大，难以被吸附或结合。,三、实验操作：包埋法固定细胞,明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。,1. 包埋法固定细胞：,即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。,2. 包埋时常用的载体包括：,海藻酸钠： 一种天然多糖，是由海带中提取的天然多糖碳水化合物，可作为食用的食品添加剂，也可作为支架材料用于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相容性使其适于作为释放或包埋药物。,三、实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,（二）用固定化酵母细胞发酵,请
5、同学们分组讨论“制备固定化酵母细胞的的操作步骤及注意事项”,小组活动：,（一）制备固定化酵母细胞,在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。,1g干酵母10mL蒸馏水50mL烧杯搅拌均匀放置1h，使之活化。,思考活化是指什么？,操作提示,酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。,1. 酵母细胞的活化：,2. 配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：,0.83gCaCl2150mL蒸馏水200mL烧杯溶解备用。,思考为什么要用蒸馏水，而不用自来水？,防止自来水中各种离子影响实验
6、结果,操作提示,配制CaCl2时要用蒸馏水；溶解物质要彻底。,3. 配制海藻酸钠溶液,0.7g海藻酸钠10mL水50mL烧杯酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸馏水定容到10mL。,加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。,思考为什么要用小火或间断加热，并不断搅拌？,防止海藻酸钠发生焦糊。,操作提示,429572439gao,4. 海藻酸钠溶液和酵母细胞混合,将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中。,以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌,思考为什么要将海藻酸钠冷却至室温？,海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底
7、充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。,操作提示,429572439gao,5. 固定化酵母细胞,以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。,思考 CaCl2溶液有什么作用？,使胶体聚沉，形成结构稳定的凝胶珠。,操作提示,滴加注射器中的溶液时，注射器距液面一定距离，滴加速度一定要恒定且缓慢，以便形成的凝胶珠呈均匀的圆形或椭圆形。 刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。,429572439gao,429572439gao,（二）用固定化酵母细胞发酵,将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次
8、。,将150ml质量分数为10的葡萄糖溶液转移至200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25C下发酵24h,思考 1. 为什么要用蒸馏水冲洗凝胶珠？,洗去凝胶珠表面多余的CaCl2溶液。以免对实验造成影响。,思考 2. 葡萄糖在这里有什么用？,既可以作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的营养物质。,429572439gao,1. 海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。,特别注意：,将很难形成凝胶珠。高浓度海藻酸钠只能用粗针头注射，针头粗也会粘着，难促使形成液滴。且高浓度海藻酸钠不易形成滴状下落，形成条状，不是圆形或是椭圆形，品相极差，并且凝胶珠容易破裂。,形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目
9、少。因为包埋不紧密，细胞容易从包埋材料中漏出。且形成的凝胶珠可能带细丝尾巴。,如果浓度过低：,如果浓度过高：,刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。 检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法: 一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。 二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。,2. 酵母细胞的固定化,（一）观察凝胶珠的颜色和形状,五、结果分析与评价,（二）观察发酵的葡萄糖溶液,如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色：,说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较
10、少；,如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：,说明海藻酸钠的浓度偏高。,二者都说明制作失败，需要再作尝试。,利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味,思考 1. 发酵过程中锥形瓶为什么要密封？,酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。,思考 2. 锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？,酵母菌进行无氧呼吸产生的。,课堂检测:,1. 制备固定化酵母细胞的过程中错误的（ ）A. 取干酵母，加入蒸馏水，使其活化B. 配制海藻酸钠时，加热用大火，直到海藻酸钠溶化为止C. 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞D. 将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右,B,2. 下
11、列叙述不正确的是（ ）A. 从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶容易B. 固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小C. 固定化细胞固定的是一种酶D. 将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细胞技术,C,课堂检测:,3.使用固定化细胞的优点是( )。A.能催化大分子物质的水解 B.可催化一系列化学反应C.与反应物易接近 D.有利于酶在细胞外发挥作用,B,课堂检测:,4.酶的固定方法不包括( )。A. 将酶吸附在固体表面上 B将酶相互连接起来C将酶包埋在细微网格里 D将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶,D,课堂检测:,5.下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是( )。A酶分子很小，易采用包埋法 B酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶C细胞个大，难被吸附或结合 D细胞易采用包埋法固定,A,课堂检测:,6.如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制( )。A直接使用酶 B使用化学方法结合的酶C使用固定化细胞 D使用物理吸附法固定的酶,C,课堂检测:,谢 谢,
