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1、第四章 分子生物学的研究方法,一、重组DNA技术,理论上三大发现技术上三大发明,遗传物质是DNA DNA双螺旋结构 遗传信息传递方式,工具酶 载体 转录酶,1973年 以DNA重组实验成功为标志,现代分子生物学,跨越天然物种屏障定向创造新物种,工具酶基因载体受体细胞,必要条件,操作过程获得外源基因（目的基因/目的片段）与载体进行体外重组形成重组体（重组子）将重组体导入（转化/转导/转染）受体细胞细胞扩增和筛选含有重组体的受体细胞（宿主细胞/寄主细胞）培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测表达产物,分、 切、 接、 转、 筛 + 检,工具酶,限制性内切酶,连接酶,修饰酶,DNA聚合酶 DNA Po
2、lymerase,逆转录酶 Reverse Transcriptase,T4多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase,碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase,活性定义限制酶的一个活性单位（1U），原则上是在50l的反应液中，37的温度条件下，经过1小时反应，将1gDNA完全分解所需要的酶量。,特点 识别部位序列一般为4、5或6个核苷酸序列； 呈双重轴对称。,限制性内切酶,性质切断识别部位或其附近特定部位后，产生两种末端，即平齐末端和粘性末端（5突出端和3突出端）。,Pst I,CTGCAGGACGTC,EcoR I,3突出,5突出,特殊的限制酶同裂酶isoschizom
3、er指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。 同尾酶isocaudamer指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端的限制性内切酶。,DNA连接酶可以催化单链DNA的连接吗？DNA连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？,连接酶,主要连接酶的功能特点,载体和插入片段具有相同的粘性末端容易连接成环状的重组DNA分子可能出现问题：载体自身环化，造成假阳性背景克隆；插入片段可双向插入；插入片段可多拷贝插入。当DNA片段两端为非同源的粘性末端可实现定向克隆，连接效率高，简捷,粘性末端连接,可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA5端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；,利用磷酸酶防止
4、载体DNA的重新环化,。,质粒载体的定向克隆,E.coli. DNA聚合酶I E.coli. DNA聚合酶I大片段（Klenow fragment） T4噬菌体DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶： Taq DNA聚合酶,DNA Polymerase,Reverse Transcriptase,Alkalinephosphatase,T4 Polymerase Kinase,细菌碱性磷酸酶BAP 牛小肠碱性磷酸酶CIP,修饰酶,载体(vector)是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建而成的。,载 体,质粒,噬菌体
5、,病毒,组合载体,种 类,能在宿主细胞中独立复制;具有多种限制酶的单一切点（多克隆位点）以便外源DNA插入；具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组分子;分子较小，便于体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；,必要条件,具备条件,表达载体:具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。,分类,克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体，通常分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如pBR322、pUC、M13等。,穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真核基因的克隆。,表达载体：以获得基因表达产物为目的的载体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数高和
6、能在宿主细胞中高效表达等特点。,克隆载体的特性 复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大,常用克隆载体 质粒 噬菌体 Cosmid 真核病毒 YAC, BAC,分类,松弛型*独立复制，拷贝数高, 10-200个拷贝/细胞，例如pUC载体可达700个/细胞严紧型受受体染色体DNA复制控制，拷贝数低，1-几个拷贝/细胞，例如pSC101,天然型人工型*,可转移型不可转移型*,氯霉素扩增氯霉素可抑制染色体DNA复制，但质粒复制不受影响，可增加拷贝数。,1、什么是质粒?2、质粒作为基因工程载体
7、的原因?3、质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点?,兼容型非兼容型*,克隆载体pUC19质粒图谱,克隆载体pBR322质粒图谱,用于原核宿主的载体,用于植物宿主的载体,用于动物宿主的载体,Ti质粒,植物DNA病毒,植物转座子,动物病毒,逆转录病毒,猿猴空泡病毒40（SV40）,昆虫杆状病毒,其他动物病毒,质粒,噬菌体,科斯质粒,?,?,?,噬菌体,双链DNA,50kb,线性噬菌体DNA分子的两端各有12个碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。,噬菌体经过改造去除中间非必需部分可以插入大片段DNA分子（约20Kb）是构建基因文库主要载体之一。,噬菌体作为基因工程载体的最主要原因是
8、什么?,其它原因呢？,置换型载体：适于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于构建基因组DNA文库。插入型载体：允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库。如gt噬菌体载体。,噬菌体载体,噬菌体载体,切除非必需的中央区,增减某些限制性酶切位点,插入适当的筛选标记基因,噬菌体,是指含有噬菌体粘性末端的杂种质粒，由DNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功能。可以克隆40-50Kb的外源DNA片段。,粘粒、柯斯质粒,科斯质粒 (Cosmid),-天然载体系统,天然载体系统：土壤脓杆菌（Ti质粒） 发根脓杆菌（Ri质粒）人
9、工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工介导等,Ti 质粒,基因导入,土壤脓杆菌植物病原菌Ti质粒感染冠瘿瘤,T-DNA特点：可自发转移，并整合进植物基因组；导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成；长度12-24Kb。,Ti质粒的功能组件：,T-DNA,由Ti质粒衍生出的载体系统,共整合载体系统,双元载体系统,MAC,哺乳动物人工染色体,人工染色体,人基因组DNA大片段的克隆,目的基因的获得(基因克隆),主要是结构基因,人工合成基因（化学合成/酶促合成）,构建cDNA文库,构建基因组文库,PCR扩增,cDNA文库的构建,提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体(常用噬菌体或质粒
10、载体)连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。,cDNA和cDNA文库,以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。,分离有目的基因表达的组织或细胞制备总RNA和分离纯化mRNA 合成cDNA第一条链合成cDNA第二条链双链cDNA的修饰双链cDNA与载体的连接,cDNA文库的构建过程,制备总RNA和mRNA的分离纯化,制备总RNA方法：异硫氰酸胍法 一步热酚法,内源RNAse的抑制：添加RNAse抑制剂， 如异硫氰酸胍等。外源RNAse的抑
11、制：0.05-0.1%DEPC处理用品， 如水、枪头、离心管等。,关键：抑制RNAse活性,焦炭酸二乙酯,亲和层析法 Oligo(dT)-纤维素柱层析,mRNA的分离纯化,模板（mRNA）引物逆转录酶底物（dNTP）buffer(Mg2+),合成cDNA第一条链,逆转录过程,条件,自身引导法置换合成法引物-衔接头法,合成cDNA第二条链,方法,自身引导法,置换合成法,甲基化加入接头,双链cDNA的修饰,小 结,cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同
12、，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。构建cDNA文库是真核生物基因克隆的常用方法。克隆cDNA可以了解蛋白质基因的结构及其表达。,基因组文库,从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库(genomic DNA library)。,原核生物基因的克隆常通过构建基
13、因组文库的方法进行。,超声波、搅拌剪切力等,限制性内切酶的不完全酶解,常用噬菌体、粘粒或YAC,PCR扩增,原理基本过程反应体系的组成,详见实验部分,融合系统和融合蛋白优点：防止表达产物被水解 可分泌到体外缺点：目的蛋白的分离纯化较麻烦瞬时表达系统与稳定表达系统,受体细胞（表达系统）,目的基因插入宿主某蛋白质的基因中形成的表达系统。,融合系统表达的目的基因产物的N端和宿主的蛋白质杂合在一起形成融合蛋白。,进入宿主的目的DNA没有和宿主DNA整合，随着细胞生长，宿主内目的基因的数量递减直至消失，表达过程只能持续数天。,进入宿主的目的DNA整合宿主染色体DNA中稳定遗传。,制备感受态细胞转化处理,
14、基因导入技术,氯化钙导入法,感受态：细胞容易吸收DNA分子的能力,原理： 细胞膜主要成分是磷脂双分子层，外加电场作用，膜两侧电位差增大，膜变的不稳定而产生孔隙，使得大小分子可进入细胞内，但此孔隙由于外加电场的移走而得到恢复，不会给细胞致命伤害。,电穿孔法（电击法）,优点：转化效率高 细菌109-1010个转化体/g DNA,结合态：重组体或含有目的基因的部分载体整合到宿主染色体上，单拷贝，稳定遗传。并存态：重组体独立存在于宿主细胞中，多拷贝，可克隆基因。两者兼有,重组体进入受体细胞后的存在状态,重组体的筛选,插入失活法,直接筛选法,利用抗生素抗性基因筛选,蓝白斑筛选法,利用营养缺陷互补筛选,插
15、入失活法,以pBR322为例,请思考：你还能设计出其它的筛选培养基吗？如果用限制酶BamHI切割pBR322质粒进行插入失活，该如何设计筛选培养基?,直接筛选法,插入失活重组AmprTets,生长受抑制（重组体）,培养细胞,Tet和环丝氨酸(一个平板),转化受体细胞,死亡（非重组体）,培养细胞,抑制细胞生长,掺入蛋白质合成导致细胞死亡,蓝白斑筛选法,-半乳糖苷酶显色反应,原理M13、pUC、pGEM等系列载体携带有一段大肠杆菌的基因LacZ，它编码-半乳糖苷酶N端的146个氨基酸，称为肽；载体的多克隆位点即处在lacZ基因区；,若多克隆位点处没有插入外源DNA片段，当载体转入基因型为LacZM
16、15（lac-）的大肠杆菌中时，质粒携带的lacZ基因将正常表达，生成肽，与宿主的产物（-半乳糖苷酶的C端肽链）互补，形成完整的-半乳糖苷酶，宿主细胞才有-半乳糖苷酶活性，这就是所谓的互补；在存在底物X-gal（乳糖替代物）和诱导物IPTG的条件下，代谢X-gal生成的产物为蓝色，即出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点处插入了外源DNA片段，将使lacZ基因失活，不能生成半乳糖苷酶，则重组克隆形成白色菌落。,请思考？若转化后的菌落全为蓝色，但通过PCR等手段检测到有目的DNA片段的插入，会有这种情况出现吗？为什么？,可能会出现，但机率较小。前提条件：插入片断较小，一般几百bp，片断的插入不破坏La
17、cZ读码框。,免疫学方法,先决条件,裂解,菌落的蛋白裸露出来,转膜,菌落印在膜上,在培养基上培养菌落,二抗与一抗结合,加一抗,一抗与裸露的蛋白质结合,洗去游离的一抗，加二抗,洗去游离的二抗，加显色剂,显色,找出阳性克隆,原理,原位杂交法,分类,原 理,原理,Southern杂交,与原位杂交的区别用于杂交的核酸需经过：分离、纯化、限制酶酶解、凝胶电泳分离，然后才能转移到膜上进行杂交。,主要分子杂交技术比较,Southern blotNorthern blotWestern blot,二、SNP技术,SNP (single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性,指基因组
18、DNA序列中由于单个核苷酸（A、T、C、G）的突变而引起的多态性。,基因组中最简单、最常见的多态性类型,RFLP 限制性片段长度多态,SSR 微卫星标记,SNP 单核苷酸多态性,遗传标记技术,突变类型,转换,颠换,C T G A,C AG TC GA T,2/3,嘧啶之间/嘌呤之间,嘧啶和嘌呤之间,基因芯片技术,SNP 检测技术应用,是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。,原理： 通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有错配碱基的序列杂交。 待测基因样品经PCR扩增及荧光化学标记后与固定的探针进行杂交。,基因芯片技术对分子生物学研究的重要意
19、义？,三、蛋白质组学技术,是蛋白质(protein)和基因组(genome)研究在形式和内容上的完美组合。,该技术是研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。,蛋白质印迹技术( Western blotting ),步骤： 制备蛋白样品 SDS-PAGE分离样品 分离的蛋白原位印迹到膜上，封闭膜上未反应的位点，抑制抗体的非特异性吸附 固定在膜上的蛋白作抗原，与一抗结合(对应的非标记抗体) 洗去游离一抗，加入二抗(酶偶联或放射性同位素标记的)，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分,检测样品中是否存在蛋白抗原,免疫印迹法,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,SD
20、S-聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE,蛋白质所带电荷以及分子大小和形状,分离依据：,不连续电泳,3种物理效应,4个不连续,不连续电泳三层凝胶的性质,SDS-PAGE,（最常用的）,SDS 十二烷基磺（硫）酸钠 1%-2%,应用：测定蛋白质的分子质量,分离依据：蛋白质分子的迁移率取决于分子质量大小，与分子形状及所带电荷无关。,为什么？,当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS和巯基乙醇，SDS能破坏蛋白质分子间的共价键，使蛋白质变性而改变原有构象，特别是强还原剂巯基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，从而
21、保证蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质-SDS复合物所带的负电荷的量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差异。另外，蛋白质-SDS复合物的形状是长椭圆形，不同蛋白质的SDS复合物短轴长度是恒定的，约为1.8nm，而长轴长度则与蛋白质相对分子质量成正比，这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小。因此，SDS-PAGE可以按蛋白质的子大小的不同将其分开。,双向凝胶电泳,等电聚焦(isoelectric focusing, IEF),SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),第一向：,依据蛋白质分子质量的不同,依据蛋白质等电点的不同,第二向：,The End of Chapter 4,
