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1、肉毒毒素介绍,主要内容,肉毒毒素介绍历史发展结构作用机理药理 毒理 免疫原性目前商用的肉毒素及保妥适的特点保妥适配制注意事项,什么是肉毒毒素?(肉毒神经毒素,肉毒杆菌神经毒素，肉毒梭菌毒素 ),是肉毒梭菌( Clostridium botulinum)在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素一种厌氧菌，其孢子常规在土壤中，与产生破伤风毒素的细菌属同一科在合适的条件下（10oC，无氧，合适的酸度）孢子生长为梭菌细菌继续产生大量的孢子或自溶将毒素释放出来不同的菌株(如Hall株,Bean株)产生不同亚型的神经毒素(分为 A、B、C、D、E、F、G等7个抗原型), 其中A型毒力最强是导致肉毒中毒(Bot
2、ulism)的原因,生物制品的特定,没有仿制品的概念肉毒毒素是一类产品名，而非通用名与疫苗接近产品本身没有专利，生产工艺专利用单位（Unit）衡量，单位之间不能换算很容易得到，很难提纯，很难恒定,不可认为肉毒毒素是相同的彼此不可换算,FDA 最新通告：,历史和发展（1）,1920s,1944,1946,首次沉淀纯化A型肉毒毒素（H.Sommer),Schantz 开始研究其特性和应用,Lammanna首次分离出A型肉毒素结晶,1820,1895,Justinus Kerner 推测“腊肠毒” 作用原理，并提出应用于治疗的可能性,E Van Ermengem 分离肉毒梭状芽胞杆菌,历史和发展（2
3、）,1960s 1970s,1978,1984,Schantz 和Scott 继续研究,Scott在猴子身上进行A型肉毒毒素治疗斜视的试验,Scott 获得FDA批准在人身上进行试验（眼睑痉挛，半面肌痉挛）,1950s,1950s 1960s,V Brook 证实A型肉毒毒素阻断乙酰胆碱释放,纯化过程优化 (Duff and Schantz),MF Brint 用于治疗眼睑痉挛，半面肌痉挛 斜颈，喉部肌张力障碍，书写痉挛等,历史和发展（3）,1998,2006,2009,FDA 批准低蛋白剂型 每100单位 5ng,1989,1997,Allergan获得FDA批准以 BOTOX 商品名上市；
4、用于治疗眼睑痉挛，斜视和第VII神经功能紊乱,Allergan 公司获得对A型肉毒素的所用权,1998年6月中国药品监督管理局批准保妥适用于治疗眼睑痉挛、面肌痉挛及相关病灶肌张力障碍。,2006年6月GSK在中国上市保妥适,2002,FDA批准美容适应症,83个国家22个适应症,2月11日获中国SFDA批准用于皱眉纹,不是个合适的生化武器,温度、湿度，空气和光照都会使毒素降解雾状的毒素，很不稳定常规的消毒方法既能使其灭活 氯， 加热85C5分钟人与人不能传播存在肉毒素抗毒素 （但对已经存在的症状无效）,高纯度的保妥适治疗不会导致肉毒中毒,肉毒中毒: 肉毒毒素导致的一种全身性的反应保妥适是高度纯
5、化的肉毒素局部注射治疗,直接注射在相关肌肉或腺体上如剂量合适,很少弥散到其它肌肉治疗剂量与中毒剂量相差很远皱眉纹标准剂量： 20U,致死剂量 (70kg 人)静脉注射 3,000 单位,要导致死亡,需静脉注射30瓶以上保妥适,每瓶保妥适只含100单位纯化的肉毒素,每瓶保妥适含蛋白5ng1ng = 10-9 g,保妥适是局部用药,Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088,本研究的临床相关性有待明确,靶肌肉,邻近肌肉,全身作用,在治疗剂量内，血液中检测不到肉毒素,前体毒素900 KD 复合体HA (Haemagglutin
6、in) ,血凝素NTNH non-toxic non-haemagglutinins 非血凝素蛋白,肉毒素结构,150 KD,100 KD,50 KD,与靶位受体结合，促轻链内转,以锌肽链内切酶实施毒效,血凝素维持毒素三维结构稳定影响结构因素：热变性，碱性条件空气/液体介面形成的气泡改变毒素形态，氮气/二氧化碳稀释至过低浓度,作用机理(1),作用机理(2),尚有其它作用机理 如疼痛,作用机理录像,作用过程,主要步骤：结合（Binding） ： A型肉毒素的重链与运动神经终板上的乙酰胆碱受体高亲和结合摄入（Internalization)：毒素通过受体介导的胞饮作用进入细胞内。这一过程中神经末端
7、细胞膜将毒素包裹，在神经末梢内形成毒素囊泡。摄入后，肉毒素的轻链从囊泡中被释放到胞浆内，现在已非常明确轻链具有阻断神经递质的功能结构。阻断 （Blocking)A型肉毒素通过裂解胆碱能神经末梢突触前膜内SNAP-25而阻滞乙酰胆碱的释放。SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合并释放乙酰胆碱的必需蛋白质。这过程阻止肌肉收缩，但并不影响神经递质的分泌和储存，也不影响电信号沿神经纤维传导。神经芽生 (Sprouting)充分证据表明肉毒素介导的神经肌肉接头的化学去神经化作用并没有影响终板区域，也没有影响轴突的生长，芽神经与终板结合连接释放神经递质神经再生“芽生”是暂时的，
8、会逐渐消退，原始的神经肌肉接头恢复功能。,乙酰胆碱的作用,颅神经,骶神经,胸腰神经,节前 神经节 节后,CNS,副交感神经,交感神经,交感神经,交感神经,躯体运动神经,Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,N,M,交感神经,NE, ,N,N,N,N,Ach,M,D,N,Epi,Ach,胆碱能性神经：运动神经全部植物神经节前纤维大多数副交感神经节后纤维支配小汗腺和血管肌肉的交感神经节后纤维,疼痛作用的发现-Rejia 试验,基本设计：36个病人有疼痛性斜颈随机，双盲分成4组 25U,50U,100U,及 150U一个治疗周期，每周观察直至12周观察指标：主要终点：TWSTRS
9、( Totonto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale) 疼痛频率疼痛强度次要终点医生及病人 全球评定量表（Global Assessment Scale),Reljia 试验结果,组1：25 U,组2：50U,组3：100 U,组4：150 U,疼痛和斜颈均无变化,斜颈无改变，但疼痛改善,疼痛改善1周后改善斜颈2周后改善,结论：保妥适可能有直接止痛效果，独立于其肌肉放松的效果,SNAP-25,Ca+ Channels,Syntaxin,VAMP/ synaptobrevin,还阻滞其它物质的释放,对疼痛的作用,Glutameat,cGRP,S
10、ubstance P,躯体运动神经元 -梭外肌-收缩减少 梭内肌-传入信号减弱,内脏运动神经元-内脏平滑肌收缩减少腺体分泌减少,痛觉感受器,肉毒毒素阻滞位点,作用机理的临床意义,BOTOX 临床应用范围日益扩大,失驰缓症,多汗症*,偏头痛,痉挛性斜颈*,脑瘫,眼睑痉挛*,神经肌肉,自主神经,感觉神经,膀胱,美容*,保妥适全球被批准情况,83个国家，22个适应症,保妥适在中国的适应症,1998： 眼睑痉挛、面肌痉挛及相关 局灶性肌张力障碍。,2009年2月：暂时改善65岁及65岁以下成人因皱眉肌/或降眉间肌活动引起的中度至重度皱眉纹。,Perform the Iodine Starch Test
11、,Use a surgical pen and standard ruler to mark injection points:1 to 2 cm apartStaggered to allow for ring effect of intradermal injections,Count injection points and allocate recommended dosage of BOTOX solution per injection, based on:50 Units per axilla,Please see Important Safety Information on
12、slide 12.,BOTOX Injection,Inject at a 45 angle to skin surfaceBevel side up to minimize leakage and ensure injections remain intradermalA depth of approximately 2 mm,Be sure not to inject directly on ink mark to avoida permanent tattoo effect,Please see Important Safety Information on slide 12.,基本药理
13、,单位的定义有效性安全性抗原性,单位的定义,生物制品用单位(Unit),而不用mg衡量肉毒素单位定义:1 Unit (单位) = i.p. LD50小鼠腹膜内注射配制后的本品溶液的半数致死量(LD50) 不同厂家的肉毒素单位（Unit）彼此不能互换有各自的实验和检测方法,说明书：本品的推荐剂量不可与其他肉毒梭菌毒素制剂的剂量互换。,文献上关于保妥适的推荐剂量只适用于保妥适，对其他A型肉毒毒素不一定适用。,有效性的判断,局部有效性：用DAS 评估Digit Abduction Score 小鼠后趾外展评分方法测试去神经化程度局部肌肉注射的 ED50 半数有效量DAS =2 时剂量,DAS 评分方
14、法,注射前,注射后,4分 严重弱化,0分 没变化,1分,2分,3分,用DAS测试小鼠肌肉弱化程度,DAS 量效关系 （对数值）,平 均 DAS 峰 值,毒素剂量, U/kg,此图可用来比较不同产品的效力,J. Francis Poster #51, Toxins 2005,平均DAS (小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度)峰值效应曲线,保妥适 效力最高的肉毒素,*p 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test,*注意： 非线性关系,局部和全身效应：弥散系数,全 身 效 应,弥散,平 均 DAS 峰 值,毒素剂量, U/kg,达到最大局部效果,弥
15、散系数 (Diffusion Margin),=,Atr thresh,ED50,Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量,作为局部注射药，肉毒素一般没有口服药所具有的全身作用在临床使用中，很多副反应是由于药物不适当弥散造成的临近肌肉全身,K. Roger Aoki, PhD, Pharmacology of Botulinum Toxins,不同产品的弥散性不一样,在达到最大局部效应前就从注射部位弥散出去了,Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088,本研究的临床相关性有待明确,抗原性,抗原:
16、能触发抗体产生的外来分子，抗原表面有非常特异性的抗体结合部位，这称为抗原决定簇。抗体: 抗体（也称为免疫球蛋白Ig）是针对抗原而产生的。只有相对应的抗原决定簇出现时，抗体才被激活。免疫应答反应具有记忆和强化功能,中和抗体使毒素失去作用,中和抗体,中和抗体,非中和抗体,非中和抗体,抗原测试方法（I）,WBA （Western Blot Analysis 蛋白印迹分析） 不能区分中和抗体和非中和抗体ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验)分析血标本中有无保妥适抗体及其含量的敏感的体外方法。 ELISA不能区分保妥适的中和抗体与非中和抗体,
17、抗原测试方法（II）,MPA (Mouse-Protection Assay 小鼠保护试验)是目前测试抗体的金标准唯一能准确测试中和抗体的方法价格昂贵、费时, 只有阴性和阳性之分FTAT (Frontalis Antibody Test 前额抗体试验)简便,很快有结果与其它方法相关性好,= 7.5 U,= 15 U,效果不佳不都是因为抗体,注射技术不正确如剂量过低或注射在错误的肌肉上对所注射的肌肉功能了解不全没有注射所有引起症状的肌肉要达到功能效果还需控制拮抗肌肌肉挛缩已到固定程度,减少抗体产生的危险,每次使用最低剂量也就是降低接触神经毒素蛋白(ng)的可能延长使用间隙由产品的作用时间决定使用
18、高纯度，性质稳定/均一的产品 新配方大大降低抗体的产生率*,Jankovic et al. (2003)Yablon et al. (2005):,保妥适的特点,目前商用肉毒素,全球第二大医药公司，占世界医药市场的62007年销售额 $45.8 billion114 个国家超过100,000名员工中国投资超过4亿美元，5 家企业 国内主要处方产品： 肝炎，代谢类，呼吸，神经,中等规模的专业生物医药公司年销售额 $3 billion, 6,000员工主要产品：医学美容：保妥适，填充剂，面霜眼科产品,GSK这样的大公司一定挑选这个领域中的最优秀产品,纯度高,质量恒定,肉毒毒素是一种生物产品，其生产
19、工艺远比化学药品复杂。很难做到批与批，瓶与瓶之间的质量恒定。 生产过程中不慎被灭活的肉毒毒素无治疗作用，但具有免疫原性，可激发肌体产生抗体，令使用者产生继发性无应答。,使用保妥适，医生可精确知道所注射的剂量，无需担心其他杂质注入使用者体内。,J. Francis Poster #51, Toxins 2005,平均DAS (小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度)峰值效应曲线。,保妥适 效力最高的肉毒素,*p 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test,*注意： 非线性关系,肉毒素彼此不等价！100U 100U,得到均一900KD大分子量,900
20、kDa,500 kDa,Schantz 纯化工艺法,均一的900KD分子量,不容易弥散到周围肌肉,保妥适: 900,000 Dalton,水18 Dalton （50,000倍）,青霉素388.48 Dalton (2,317倍）,分子量比较,弥散系数比较,Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量在达到相同的疗效时, 保妥适比其它肉毒素更不容易弥散到远端肌肉,J. Francis Poster #51, Toxins 2005 Presented at Toxins 2005, Denver, CO, June 22-25, 2005.,良好的弥散系数,全 身 效 应,
21、弥散系数 (Diffusion Margin),=,Atr thresh,ED50,Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量,作为局部注射药，肉毒素一般没有口服药所具有的全身作用在临床使用中，很多副反应是由于药物不适当弥散造成的临近肌肉全身,在达到最大局部效应前就从注射部位弥散出去了,Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量,临床相关性需进一步确认,保妥适能更好地集中在靶肌肉上,保妥适使用真空干燥法,真空干燥法Vacuum Dried,液体 固体,冰冻干燥法Lyophilized,固体 固体,保妥适,其它A型肉毒素,冻干易形成类毒素无活性，但有免
22、疫原性需要明胶作为稳定剂来降低冻干损失量,明胶是强致敏剂,明胶可对冻干中的蛋白质起保护作用可能会引起疯牛病是强过敏源，国际上已不推荐为敷料,国内的临床实验也显示， CBTX-A 组 5 例出现皮疹； BOTOX组无一例发生。,Blair et al. J Clin Neurosci 2004;22(Suppl 1):S103-4 ABS-POS3R NOT porcine汤晓芙万新华A 型肉毒毒素治疗局限性肌张力障碍和肌肉痉挛中华神经科杂志1999年6月第32卷第3期,含有明胶的肉毒素是强致敏剂反复暴露会增加皮肤过敏率,图示为动物实验中的结果,保妥适始终是市场的领导者,Source: AGN
23、Global Mkt Research,2007 WW BoNT Market Sales $1.4 B,我们更关心产品销售出去后的问题,持续性地在全球收集安全性数据,不良反应维持在较低水平,大量的文献支持保妥适有效性和安全性,近4,000份资料宽度：100多个用法时间： Mejia N et al平均15.8年,Mejia N et al. Long-term botulinum toxin efficacy, safety and immunogenicity. Mov Disord 2005; 20(5):592597.,我们力求提供给医生最有价值的服务,我们力求提供给医生最有价值的服务
24、,注射软件,注射记录表,外科记号笔,保妥适配制方法,包装和防伪,包装规格：1支/盒容器：带橡胶塞并用铝箔密封的10ml容量的I型无色玻璃瓶。小瓶的标签上印有“Allergan”字样的全息胶皮,上有平行的彩虹条文为了能看到全息图片,需要在台灯或荧光灯下前后旋转小瓶在生长日期/批号地方没有全息图片,配制步骤: 1,最好在塑料布上进行配制，以防止液体的外溅。选用21Gauge（ 0.813mm）, 约1.5英寸（3.8cm）长的针头抽取适量(参见稀释表)的 不含防腐剂的生理盐水 (0.9% 氯化钠液),以45的角度将针插入保妥适瓶内，瓶内真空会将生理盐水自动吸入,为避免产生过多泡沫,请稍用力持住筒芯
25、,使生理盐水缓慢进入。这一过程能检验瓶内是否真空，若为非真空则弃用。,配制步骤: 2,将注射筒从针头上拔下，让空气通过针头进入瓶内，中和负压。轻轻地旋转小瓶，使保妥适在生理盐水中溶解，不要翻转震动瓶子。,配制步骤: 3,用另一新的无菌注射筒接上针头，从瓶底一角抽出稀释液，勿将小瓶翻转。,配制步骤: 4,将用于配制的21Gauge( 0.813mm）针头拔下，换上与所注射适应症相应的针头：眼睑痉挛、面肌痉挛使用30Gauge（ 0.305mm）针头；如需肌电图引导定位，使用涂有特氟隆的针头.,配制步骤: 5,稀释表,配制好的溶液应是无色至淡黄色的液体，不含任何颗粒使用配制溶液之前应肉眼检查澄明度
26、及有无杂质，本品只能单次使用，剩余溶液应丢弃。,附件针头度量,ISO 9626: Stainless steel needle tubing for the manufacture of medical devices, Amendment 1. Geneva: International Organization for Standardization, 2001: 12.,废弃物处置,未用过的药瓶:应用少量水稀释，然后高压灭菌所有用过的药瓶、注射器和沾有溅出液的器具高压灭菌消毒0.5% 或 1%次氯酸盐溶液消毒5分钟，灭活残留物,主要参考资料,Allergan Foundation Tra
27、ining ManualBotox Product InformationDas Gupla BR,Toxin,1984;22:415-42 Duff JT,JBacteriol, 1956;72:455-460J. Francis,et al. Poster #51, Toxins 2005 Presented at Toxins 2005，Denver，CO,June 22-25，2005Aoki KR, Toxin,2002; 40(7):923-928Edward J.Schantz,et al.Properties and use of botulinum toxin and oth
28、er microbial neurotoxins in medicine. Microbiological reviews.1992;56(1):80-99Foster AF et al. Botulinum neurotoxin from laboratory to bedside. Neurotoxicity Research 2006; 9(2,3): 133-40.汤晓芙等.A型肉毒毒素治疗局限性肌张力障碍和肌肉痉挛.1999；32（3）：135-138J. Jankovic,et al. Comparison of efficacy and immunogenicity of original versus current botulinum toxin in cervical dystonia. Neurology. 2003;60:11861188,谢谢！,
