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1、第八章 核酸的生物合成,本章重点介绍遗传中心法则和DNA、RNA的生物合成，对基因工程作一般介绍。,DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。,中心法则(Central dogma),生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质
2、多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,目 录,第四节 基因工程及分子生物学技术简介,第一节 DNA的生物合成,第二节 RNA的生物合成,第三节 核酸合成的抑制剂,第
3、一节 DNA的生物合成,一、DNA的复制 （DNA指导下的DNA合成）,三、DNA突变,四、 DNA的损伤与修复,二、逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）,第一节 DNA的生物合成,复制：遗传信息从亲代DNA传递到子代DNA分子上。,2/62,一、 DNA半保留复制(Semiconservative Replication),定义：子代DNA双链中的一条链来自 母链，另一条链重新合成。,3/62,(深蓝: 15N),(粉红: 14N),DNA半保留复制的证据,4/62,半保留复制的意义：遗传稳定性的分子机制。,但是：遗传稳定性是相对的，生物界存在普遍的变异现象,基因表达：包括转录和翻译,6
4、/62,二、 DNA复制的酶学,1. 底物：dATP，dGTP，dCTP，dTTP，总称为dNTP,2. DNA聚合酶，DNA-pol,3. 模板（template）：解开成单链的DNA母链,4. 引物（primer）：RNA引物,5. 其他酶和蛋白质因子,7/62,一）复制的化学反应,磷酸二酯键的生成,3,5,+dN2TP,+PPi,8/62,DNA pol,二） DNA聚合酶（DNA polymerase, DNA-pol） 即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,真核生物有多种： DNA-pol 、,原核生物有3种： DNA-pol、 、 ,9/62,表13-1 大肠杆菌中DNA聚合酶
5、某些性质 DNA-pol 性质 酶分子/细胞 400 40 20活性（nt/min） 1000 50 1000005 3 聚合功能 有 有 有5 3 外切酶活性 有 有 无3 5 外切酶活性 有 有 有主要功能 校读 ,修复 不清 复制 填补缺口,10/62,The model of DNA-pol III, form the catalytic core, Links two cores, act as a clamp,11/62,小片段,大片段（Klenow fragment）,5 3 聚合功能，3 5 外切酶活性,5 3 外切酶活性,DNA pol I,12/62,真核细胞中DNA聚合酶
6、,种类： DNA-pol 、,DNA-pol ：合成随后链,DNA pol ：合成先导链,DNA-pol ：校对，修复和填补缺口,DNA-pol : 线粒体DNA复制,DNA-pol ：功能不清,13/62,质粒与线粒体DNA是细胞核染色体外的遗传物质。能进行自我复制。,质粒是基因工程的常用载体,线粒体DNA(mtDNA)全长16kb，有37个基因，编码与ATP合成有关的酶和蛋白质。,特点：,1. 母系遗传,2. DNA损伤后不易修复,3. 遗传密码与通用遗传密码有差别,14/62,UGA（终止密码子）：Trp,AGA/AGG（Arg）：终止密码子,AUA（Ile）：Met（起始密码子）,DN
7、A-pol 的 53聚合作用,15/62,35外切,5 3外切,5,3,内切酶（or限制性内切酶）,35外切,5 3外切,外切酶与内切酶作用图解,16/62,DNA-pol I 5 3外切酶活性的功能：,切除引物，切除突变片段,DNA-pol I 35外切酶活性的功能：,校读（proofread）功能,17/62,DNA复制的保真性(fidelity),1.严格遵守碱基配对规律,2. DNA-pol在复制过程中对碱基的选择性,3. 复制出错时有即时的校读功能,DNA pol III在催化磷酸二酯键形成之前完成对碱基的选择；对反式嘌呤核苷酸的亲和力较顺式的大。,18/62,三）复制中解链和DNA
8、分子的拓扑学变化,解链酶类：,1. 解螺旋酶(helicase) DnaB,2.拓扑异构酶（topoisomerase I、II）解旋酶，,3.单链DNA结合蛋白(single stranded DNA-binding protein,SSB),19/62,1.解链（螺旋)酶 (helicase),作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链。,ATP,20/62,2. 拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）,拓扑(topology)与拓扑异构,DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑异构酶,21/62,切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DN
9、A分子成负超螺旋再连接切口。,不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后, 连接切口。,Topo:,Topo:,临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞的。,22/62,Topo酶：切割DNA链，使其松弛后再连接。,3. 单链DNA结合蛋白（single stranded binding protein，SSB）,作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解。,23/62,四、引物酶(Primase)和引发体,催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。,DNA合成需在RNA引物的基础上进行。,24/62,
10、DnaA,引发体（primosome）：包括解螺旋酶 、DnaC、引物酶（ DnaG ）及DNA复制的起始区域。,25/62,五、 DNA连接酶(DNA ligase),功能：,催化DNA双链的3羟基和相邻的5磷酸基团形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。,DNA连接酶,ATP,ATP,26/62,参与DNA复制的主要成员,主要成员,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶 解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPO 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DN
11、A连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,27/62,三、DNA生物合成过程,1.复制的起始,2.链的延长,3.复制的终止,28/62,S,G1,M,G2,蛋白质合成期,DNA合成期,哺乳动物的细胞周期,29/62,复制的起始,(一)DNA解成单链,由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉。,30/62,倒Y,E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，有3组串联重复序列和2对反向重复序列。,GATTNTTTATTTGATCTNTTNTATTGATCTCTTATTAG,串联重复序列,反向重复序列,TTTGG
12、ATAA.TTATCCACA AATAGGT-T,TGTGGATTATTATACACA A-TA-GTGT,31/62,回文结构,(二)引发体的生成,解螺旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体。,32/62,（三） RNA引物的合成,33/62,小节,参与复制起始的成员,名称,功能,DnaA蛋白 辨认起始点,解螺旋酶（DnaB，Rep）解开DNA双链,DnaC 协助解螺旋酶,引物酶（DnaG） 催化RNA引物生成,SSB 稳定解开的单链,拓扑异构酶 理顺DNA链,OriC E.coli复制起始点,34/62,引物合成后，由DNA pol（在真核细胞为DNA聚合酶和)催化，按碱基配对原则，将dNTP
13、逐一添加到引物3 末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长。,复制的延长,3AAGACCTATT5,5TTCTGGATAA3,35/62,dATP,+,DNA pol,36/62,领头链（leading strand）,随从链（lagging strand）,冈崎片段(Okazaki fragment),37/62,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,DNA的复制过程：,1.半不连续性：DNA复制过程中，一条链是连续复制，另一条链是不连续复制的现象。,有关复制延长的几个重要概念,4. 冈崎片段（Okazaki fr
14、agment）： 不连续复制的片段,3. 随从链: 链的延长方向(53)与解链方向相反，为不连续复制。,2.领头链:链的延长方向(5 3)与解链方向相同, 为连续复制。,38/62,5. 双向复制,6. 复制子(replicon),真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段。,以起始点为中心，向两个方向进行复制。,39/62,滚环复制,是某些病毒，质粒、线粒体DNA的特殊复制形式。,40/62,复制的终止,原核生物复制终止 真核生物复制终止,41/62,1、原核生物DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点。,原核生物复制终止,2. 领头链上的RNA引物被RNA酶水解后，由DNA pol I
15、 催化，由新合成链提供-OH补齐。,RNA酶,DNA pol I,连接酶,42/62,3、冈崎片段引物的消除和连接。,RNA引物,RNA酶,DNA pol I,DNA连接酶,43/62,真核生物的端粒(telomere)和端粒酶(telomerase),真核生物DNA末端结构是端粒，在端粒酶的作用下形成 。,（TTAGGG）n,44/62,端粒酶：由RNA与蛋白质组成，具逆转录酶活性，以自身RNA为模板合成DNA。,Binding,Elongation,Translocation,Telomerase,45/62,爬行模型：Inchworm（尺蠖）model,Elongation,Primer
16、synthesis,Primase,DNA polymerase,DNAreplication,Primerremoval,46/62,真核和原核DNA细胞复制比较,端粒酶使线形DNA分子的末端保持不变,新合成链提供-OH补齐,复制终止,四、 DNA损伤（突变）与修复,DNA分子一级结构的改变称为DNA损伤(DNA damage)或突变（mutation）。,大多数突变属此类，原因不明,由理化及生物因素诱发,DNA的损伤（突变）的概念,自发突变：,诱发突变：,47/62,遗传重组不属突变的范畴。,一）基因突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）只有基因型改变的突变,（三）致死性的突
17、变,（四）突变是某些疾病的发病基础,同义突变,某些非编码区的突变,DNA多态性：个体间DNA序列的差异,48/62,如遗传性疾病，高血压，肿瘤，糖尿病等等。,UV,二）引发突变的因素,物理因素,紫外线(产生胸腺嘧啶二聚体， ）,49/62,环丁基环,化学因素,烷化剂：(如氮芥类)，使鸟嘌呤的 N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点,亚硝酸盐：使碱基氧化脱氨基,CU,AI,GX,碱基类似物,如5-溴尿嘧啶(5-BU)与T类似，但5-BU可与G配对,羟胺类：C被羟胺化后与A配对,50/62, A5-BU, G5-BU,51/62,三、突变的类型,1. 点突变（point mutation）也称错配（
18、mismatch）,DNA链上碱基的置换,HbA 肽链,HbA 基因,HbS 基因,HbS 肽链,52/62,2. 缺失、插入和框移突变（frame shift）,5. UCACGACAUAUG.3,5.UCAGCGACAUAUG.3,丝,精,组,蛋,丝,丙,苏,酪,5. UCAGACAUAUG.3,丝,天,异亮,插入,缺失,正常,框移突变是最严重的突变！,人之初，性本善，性相近，习相远,人初性，本善性，相近习，相远,53/62,3. 重排(rearrangement)与重组(recombination),DNA分子发生较大片段的交换,Hb 基因家族,ABCD,ABDC,ABCD,EFGH,A
19、BGH,EFCD,54/62,四）DNA损伤的修复,T-T,1. 光修复,55/62,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,2.切除修复：由3种酶共同参与完成。,UvrC切除,DNA pol I,DNA连接酶,UvrA，UvrB识别并结合,56/62,XP,XP,DNA pol ,3.重组修复,RecA,DNA pol,切除修复,57/62,4. SOS修复：DNA分子多处受到较大范围的损伤，细胞所作出的一系列反应。,细胞能继续生存，但引起DNA较长期的广泛的突变。,后果：,SOS修复系统：Uvr类，Rec类，D
20、NA pol，LexA等组成调节子（regulon）网络系统。,特点：抑制细胞分裂，允许大量快速的切除修复和重组修复， 允许损伤的DNA作为模板进行复制，对碱基选择性低等。,58/62,五、逆转录现象和逆转录酶,逆转录酶（reverse transcriptase）又称为反转录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶 (RNA-dependent DNA polymerase, RDDP),以RNA为模板，dNTP为原料，按碱基配对规律合成DNA的过程，由逆转录酶催化。,逆转录现象,59/62,逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性：,1. 逆转录活性：即以RNA为模板合成DNA,2. RNase活性：水解R
21、NA:DNA中的RNA,3. DNA pol活性：以DNA为模板合成DNA,60/62,RNA模板,逆转录酶的逆转录活性,逆转录酶的RNase活性,RNA:DNA杂化双链,单链DNA,逆转录酶的DNA pol活性,整合(integration)入细胞基因组,双链DNA,病毒基因组通过基因重组插入到宿主细胞基因组中，称为整合。,61/62,逆转录及逆转录酶的生物医学意义,1. 丰富和发展了中心法则,2. 丰富和发展了致癌理论,3. 在基因工程中的应用,RNA也可作为遗传信息的载体,RNA在进化中可能比DNA更原始,癌基因与病毒致癌理论,逆转录酶广泛应用于基因工程中,逆转录病毒是基因治疗的常用载体
22、,62/62,2. 逆转录与癌变 致癌病毒多数是RNA病毒，少数是DNA病毒，致癌病毒感染宿主细胞后，致癌基因由病毒基因整合到宿主细胞的染色体中，致癌基因可表达成蛋白质，此蛋白使正常细胞转变为癌细胞。致癌病毒已证实40余种致癌基因，已知20种以上的 逆转录病毒致癌基因. 有相应的正常细胞基因，称作细胞原癌基因（c-onc），它们只有在特定条件下，才引发癌变。,这些致癌基因按其蛋白质产物可分以以下五类： 1.src 家族:10余种基因,表达酪氨酸蛋白激酶类; 2.ras 家族:多种表达信息传递蛋白质基因,G蛋白; 3.myc家族:数种表达DNA结合蛋白基因,起转录调控; 4.sis家族:致癌基因是为生长因子编码的基因; 5.erb 家族:四种表达细胞骨架蛋白质基因,与细胞形态和运动有关。 致癌基因的发现，使肿瘤发病机制的研究深入到分子水平，而有关致癌基因在什麽情况下才会表达成癌细胞，将是一个十分重要的课题。,
