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1、代谢控制发酵课程,第一章 微生物的代谢,第一节 微生物的代谢体系,代谢（Metabolism）是细胞内发生的各种化学反应的总称，也就是发生在微生物细胞内各种生物化学反应的总称。,分解代谢,合成代谢,合成代谢与分解代谢在生物体中耦联进行，它们之间既有明显差别，但又紧密相关。分解代谢为合成代谢提供所需要的能量和原料，而合成代谢则是分解代谢的基础。在代谢过程中，微生物通过分解代谢产生化学能，光合微生物还可将光能转换成化学能，这些能量除用于合成代谢外，还可用于微生物的运动和运输，另有部分能量以热或光的形式释放到环境中去。,初级代谢和次级代谢,初级代谢：能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或提供生长
2、能量的一类代谢。产物有小分子前体物、单体、多聚体等生命必需物质；次级代谢：某些微生物在一定生长时期出现的一类代谢。产物有抗生素、酶抑制剂、毒素、甾体化合物等，与生命活动无关，不参与细胞结构，也不是酶活性必需，但对人类有用。二者关系：先初后次，初级形成期也是生长期，只有大量生长，才能积累产物。,第二节 微生物产能与耗能代谢,一、能量转换,ATP是能量转换的枢纽物质,1.底物水平磷酸化（Substrate Level Phosphorylation）不需氧 通过转移底物在生物氧化过程中形成的高能化合物的高能磷酸键，直接形成ATP的过程称为底物水平磷酸化。 特点：底物在生物氧化中脱下的电子或氢不经过
3、电子传递链传递，而是通过酶促反应直接交给底物自身的氧化产物，同时将释放出的能量(一般通过高能磷酸键)交给ADP，形成ATP。底物水平磷酸化是微生物在发酵中产生ATP的唯一方式，在呼吸过程虽也存在，但处于次要地位。,底物在生物氧化过程中放出的电子通过电子传递链传到氧或其他氧化物(如NO3-1)，同时形成ATP的过程称为氧化磷酸化或电子传递磷酸化。 其核心为电子传递链（ETC, electron transport chain)，或称为呼吸链（RC, respiratory chain）。ETC由若干个氢和电子传递体按氧化还原电位高低顺序排列而成，相当于一段由有机物分子连接而成的“生物导线”，电子
4、在该导线上流动，产生ATP。组成ETC的成员主要有醌及醌衍生物、细胞色素、铁硫蛋白及黄素蛋白4类化合物。,2. 氧化磷酸化（Oxidatire Phosphorylation） 需氧,二、微生物的产能代谢,（一）化能异养微生物的生物氧化,1、发 酵,发酵(fermentation)是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。在发酵条件下有机化合物只是部分地被氧化，因此，只释放出一小部分的能量。发酵过程的氧化是与有机物的还原耦联在一起的。被还原的有机物来自于初始发酵的分解代谢，即不需要外界提供电子受体。 发酵的种类有很多，其
5、底物有碳水化合物、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。,葡萄糖是异养微生物的主要碳源和能源，可直接进入糖代谢途径被降解成小分子物质丙酮酸。主要分为四种途径：（1）EMP途径：糖酵解途径（2）HMP途径：戊糖磷酸途径（3）ED途径：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）途径（4）PK途径：磷酸解酮酶途径,（1）EMP途径主要生理功能是：1、提供ATP和NADH2、中间产物又可提供微生物合成代谢的碳骨架3、可逆转合成多糖 无氧条件下，该途径产能效率很低，但多种中间代谢物不仅可为合成反应提供原材料，而且起链接许多有关代谢途径的作用，可用于多种发酵产品的生产。,（2）HMP途径,从
6、葡萄糖-6-P开始，即单磷酸己糖基础上开始降解，故亦称为单磷酸己糖途径，磷酸戊糖支路（HMP途径中3-P-甘油醛可以进入EMP途径）。HMP途径的总反应可用下图表示：,戊糖磷酸途径的概况,一般认为HMP途径不是产能途径，而是为生物合成提供大量的还原力NADPH和中间代谢产物，如核酮糖-5-P是合成核酸、某些辅酶及组氨酸的原料；NADPH是合成脂肪酸、类固醇和谷氨酸的供氢体。另外，核酮糖-5-P还可以转化为核酮糖-1,5-二磷酸，在羧化酶作用下固定CO2，对于光能自养菌、化能自养菌具有重要意义。,HMP途径是戊糖代谢的主要途径，其生理意义： 为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸； 产生大量的N
7、ADPH，一方面参与脂肪酸、固醇等细胞物质的合成，另一方面可通过呼吸链产生大量的能量； 四碳糖（赤藓糖）可用于芳香族氨基酸的合成； 在反应中存在3 7碳糖，使具有该途径的微生物的碳源谱更广泛； 通过该途径可产生许多发酵产物，如核苷酸、氨基酸、辅酶、乳酸等。,单独HMP途径较少，一般与EMP途径同存,（3）ED途径,ED途径是1952年在研究嗜糖假单胞菌（Pseudomonas Saccharophila）时发现的。在ED途径中，葡萄糖-6-P首先脱氢产生6-P-葡萄糖酸，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生甘油醛-3-P和丙酮酸，然后甘油醛-3-P进入EMP途径转变成丙酮酸。1分子葡萄糖经ED途
8、径最后生成2分子丙酮酸，1分子ATP，1分子NADPH和NADH。ED途径可不依赖于EMP、HMP途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化类的ATP的厌养菌而言，ED途径不如EMP途径经济。,ED途径是少数EMP途径不完整的细菌例如假单胞菌和发酵单胞菌等所特有的利用葡萄糖的替代途径，包括铜绿、荧光假单胞菌，根瘤菌，固氮菌，农杆菌，运动发酵假单胞菌等。 其特点是利用葡萄糖的反应步骤简单，产能效率低（1分子葡萄糖仅产1分子ATP，仅为EMP途径之半），反应中有一个6碳的关键中间代谢物KDPG。由于ED途径可与EMP途径、HMP途径和TCA循环等各种代谢途径相连接，因此可以相互协调，以满足微生物对能量
9、、还原力和不同中间代谢物的需要。,在不同的微生物中，EMP、HMP和ED途径在己糖分解代谢中的重要性是有明显差别的。在微生物细胞中，有的同时存在多条途径来降解葡萄糖，有的只有一种。在某一具体条件下，拥有多条途径的某种微生物究竟经何种途径代谢，对发酵产物影响很大。,（4）磷酸解酮酶途径,磷酸解酮酶途径是明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解己糖和戊糖的途径。没有EMP、HMP、ED途径的细菌通过PK途径分解葡萄糖，产物有乙酸、乳酸等。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶。 根据解酮酶不同： 具有磷酸戊糖解酮酶的称PK途径，肠膜明串珠菌、番茄乳杆菌、甘露醇乳杆菌、短杆乳杆菌； 具有磷酸己糖解酮酶的叫HK途径
10、，双歧杆菌。,在无氧条件下，以葡萄糖分解过程中形成的各种中间产物作为受体来接受NADH + H+ 和 NADPH + H+的氢，于是产生了各种各样的发酵产物。,由EMP途径中丙酮酸出发的发酵,H小于7.5（一般控制在3.54.5）,乙醇发酵特点：发酵基质氧化不彻底，发酵结果仍有有机物；酶体系不完全，只有脱氢酶，没有氧化酶；产生能量少。,通过ED途径进行的乙醇发酵（细菌的乙醇发酵）参与微生物：运动发酵假单胞菌,同型乳酸发酵：发酵产物只有乳酸，产生2分子ATP；异型乳酸发酵（通过HMP途径或PK途径）：发酵产物除乳酸外还有乙醇与CO2。,表 同型乳酸发酵与异型乳酸发酵的比较,2、呼吸作用,微生物在
11、降解底物过程中，将释放出电子传给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程称为呼吸作用。呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后再交给最终电子受体。其中，以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸（aerobic respiration），以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸（anaerobic respiration）。,许多不能被发酵的有机化合物能够通过呼吸作用被分解，是因为在进行呼吸作用的生物电子传递系统中发生了NADH的再氧化
12、和ATP的生成。因此，只要生物体内有一种能将电子从该化合物转移给NAD+的酶存在，而且该化合物的氧化水平低于CO2即可。能通过呼吸作用进行分解的有机物包括某些碳水化合物、脂肪酸、许多醇类。但对人造化合物，如PVC、PP等，微生物的呼吸作用具有显著抗性，可在环境中积累，造成有害的生态影响。,（1）有氧呼吸,根据原核生物与真核生物不同，葡萄糖完全氧化总共可获得30或32个ATP。,（2）无氧呼吸,某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸，如铜绿假单胞、地衣芽孢杆菌等。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等这类外源受体。无氧呼吸也需要细胞色
13、素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴有磷酸化作用，也能产生较多的能量用于生命活动。但由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。,（二）化能自养微生物（以无机物CO2为唯一或主要碳源）的生物氧化,化能自养菌是一类从无机物的氧化中得到能量(ATP)和还原力(NADH2或NADPH2)，再通过卡尔文循环同化CO2的微生物。专性化能自养菌不吸收利用有机物，故不能像异养细菌通过糖酵解和TCA产能。研究证明，某些专性自养菌缺乏一些关键酶，它们的EMP、ED不完全，TCA也存在缺陷：缺乏由TCA中间产物C6或C5产生C4化合物的机制。尽管如此，这些菌却有HMP途径，能沟
14、通糖类进入TCA，并像厌氧微生物那样，能通过有缺陷的TCA获得生物合成所需中间产物。专性化能自养菌氧化无机物时，将产生的电子通过ETC传给氧，其产能过程需要氧，故所有专性化能自养菌都是好氧的。,（二）化能自养微生物的能量代谢,一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类细菌称为化能自养微生物。它们在无机能源氧化过程中通过氧化磷酸化产生ATP。,化能自养菌的分类和一般特征,1、硝化细菌的能量代谢,氨氧化为硝酸的过程可分为两个阶段，先由亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸，再由硝化细菌将亚硝酸氧化为硝酸。由氨氧化为硝酸是通过这两类细菌依次进行的。硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性菌，以分子氧
15、为最终电子受体，且大多数是专性无机营养型。,2、硫细菌的能量代谢,硫杆菌能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物（包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐）作能源。H2S首先被氧化成元素硫，随之被硫氧化酶和细胞色素系统氧化成亚硫酸盐，放出的电子在传递过程中可以偶联产生4个ATP。亚硫酸盐的氧化可分为两条途径，一是直接氧化成SO42-的途径，由亚硫酸盐-细胞色素C还原酶和末端细胞色素系统催化，产生1个ATP；二是经磷酸腺苷硫酸的氧化途径，每氧化1分子SO42-产生2.5个ATP。,（三）光能自养菌的能量代谢,光能微生物可从阳光中获取能量，通过光合磷酸化产能，即能将光能转变成ATP
16、形式的化学能。,光能转变为化学能的过程 光合磷酸化（Photophosphorylation）当一个叶绿素分子吸收光量子时，叶绿素性质上即被激活，导致叶绿素（或细菌叶绿素）释放一个电子而被氧化，释放出的电子在电子传递系统中的传递过程中逐步释放能量，这就是光合磷酸化的基本动力。 1、循环（环式）光合磷酸化 2、非循环（非环式）光合磷酸化,（1）依赖于菌绿素的光合作用循环光合磷酸化（cyclic-photophosphorylation）,一种存在于厌氧光合细菌中的利用光能产生ATP的磷酸化反应，由于它是一种在光驱动下通过电子的循环式传递而完成的磷酸化，称循环光合磷酸化。这类细菌包括紫色硫细菌/非
17、硫细菌、绿色硫细菌/非硫细菌。其特点是：在光能的驱动下，电子从菌绿素分子上逐出后，通过类似呼吸链的循环，又回到菌绿素，其间产生了ATP；产物只有ATP，无NADP（H）；还原力来自H2S等的无机氢供体；不产生氧。,ATP,（2）依赖于叶绿素的光合作用非循环光合磷酸化（noncyclic photophosphorylation）,这是各种绿色植物、藻类和蓝细菌所共有的利用光能产生ATP的磷酸化反应。其特点是：电子的传递途径属非循环式的；在有氧条件下进行；有两个光合系统，其中的色素系统（含叶绿素a）可以利用红光，色素系统（含叶绿素b）可利用蓝光；反应中同时有ATP（产自系统）、还原力H（产自系统
18、）和O2产生；还原力NADPH中的H是来自H2O分子光解后的H+和e-。,（3）两种光合作用的异同点比较,三、微生物的耗能代谢,微生物通过发酵、呼吸和光合磷酸化获得能量。所得能量或被细胞直接利用，或者形成ATP等高能化合物，或者使细胞膜处于充能状态(即建立能化膜)。能化膜贮存的能量可用于细胞运动、物质运输，也可以通过驱动ATP酶合成ATP。微生物通过不同途径合成的ATP主要用于细胞物质与代谢产物的合成，其余部分用于维持生命、生物发光或以生物热放出。,合成耗能：物质合成消耗的能量包括合成原料进入细胞时主动运输、单体合成、大分子细胞物质合成及代谢产物合成消耗的总能量。 主动运输耗能细胞运动：大多数
19、可运动的原核生物是利用鞭毛运动的。在真核微生物中，鞭毛和纤毛均具有ATP酶，水解ATP产生自由能，称为运动所需的动力。,发光：在海洋和淡水水体中，有一些细菌能发光。在一定条件下，发光细菌能将细胞内贮存的化学能转化为光能。,目前国内常用的3种发光细菌为：明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌。,（一）合成代谢与分解代谢的关系,对糖类、氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶等主要细胞成分而言，合成代谢和分解代谢存在共同的中间代谢物。例如由分解代谢产生的丙酮酸、乙酰CoA、草酰乙酸、3-P甘油醛等化合物亦可作为合成反应的起始物。,（1）生物合成途径中一个分子的生物合成途径与它的分解代谢途径通常是不同的，其中可能有相同
20、的步骤，但导向一个分子的合成途径与从该分子开始的降解途径间至少有一个酶促反应步骤是不同的。（2）需能的生物合成途径与产能的ATP分解反应相偶联，因而生物合成方向是不可逆的。（3）调节生物合成的反应与相当的分解代谢途径的调节机制无关，因为控制分解代谢途径速率的调节酶，并不参与生物合成途径。生物合成途径主要是被它们的末端产物浓度所调节。,（amphibolic pathway）,1、,在两用代谢途径中，合成途径并非分解途径的完全逆转，即催化两个方向中的同一反应并不是总是用同一种酶来进行的。例如，葡萄糖合成中，有两个酶与分解代谢时不同，即由果糖二磷酸酶（而不是磷酸果糖激酶）来催化果糖-1，6-二磷酸
21、至果糖-6-磷酸的反应，由葡萄糖-6-磷酸酶（而不是己糖激酶）来催化葡萄糖-6-磷酸至葡萄糖的反应。在真核生物中，合成代谢和分解代谢一般在细胞的不同区域中分隔进行，即合成代谢一般在细胞质中进行，而分解代谢则多在线粒体和微粒体中进行，这就有利于两者可同时有条不紊地运转。,2、代谢回补顺序（anaplerotic sequence）,指能补充两用代谢途径中因合成代谢而消耗的中间代谢产物的那些反应。与EMP途径和TCA循环有关的回补顺序约有10条。主要围绕EMP途径中的PEP和TCA循环中的OA这两种关键性中间代谢物来进行。,（二）微生物独特合成代谢途径,1、自养微生物的CO2固定2、生物固氮3、微
22、生物结构大分子肽聚糖的合成4、微生物次级代谢物的合成,1、CO2固定,CO2是自养微生物的唯一碳源，异养微生物也能利用CO2作为辅助的碳源。将空气的CO2同化成细胞物质过程，称为CO2的固定作用。 自养微生物将CO2加在一个特殊的受体上，经过循环反应，使之合成糖并重新生成该受体。在异养微生物中CO2被固定在某种有机酸上。因此异养微生物即使能同化CO2，最终却必须靠吸收有机碳化合物生存。 自养微生物同化CO2所需的能量来自光能或无机物氧化所得的化学能，固定CO2的途径主要有以下三条：,（1）卡尔文循环（Calvin cycle）化能自养微生物和大部分光合细菌中,（2）逆向TCA循环（revers
23、e TCA cycle） 在光合细菌、绿硫细菌中发现此途径,每循环一次可固定4分子CO2，合成1分子草酸乙酰，消耗3分子ATP，两分子NAD（P）H和一分子FADH2。,（3）羟基丙酸途径（hydroxypropionate pathway）,2、生物固氮,生物固氮是指分子氮通过固氮微生物固氮酶系的催化而形成氨的过程。这是一种极其温和的生物化学反应，它比人类发明的利用铁催化剂、在高温（约300）、高压（约300个大气压）下的化学固氮要优越得多。 固氮微生物有80余属，全部为原核生物(包括古生菌），主要包括细菌、放线菌和蓝细菌。可分为3类：自生固氮微生物、共生固氮微生物、联合固氮微生物。,自生固
24、氮菌：独立进行固氮，但并不将氨释放到环境中，而是合成氨基酸；固氮效率较低。, 固氮微生物,共生固氮菌：与其他生物形成共生体，在共生体内进行固氮；将固氮产物氨，通过根瘤细胞酶系统的作用，及时运送给植物体各部，直接为共生体提供氮源。其固氮效率比自生固氮体系高得多。,联合固氮菌：必须生活在植物根际、叶面或动物肠道等处才能进行固氮的微生物。联合固氮作用是固氮微生物与植物之间存在的一种简单共生现象。不形成根瘤，但有较强的专一性，固氮效率比自生条件下高。,固氮机制,生物固氮反应的6个条件：,固氮反应的总式为：,肽聚糖的合成,次生代谢物的合成,合成途径：糖代谢延伸途径；莽草酸延伸途径；氨基酸延伸途径；乙酸延
25、伸途径,复习题,1、名称解释：生物氧化、有氧呼吸、无氧呼吸、发酵、电子传递链（呼吸链）、光合磷酸化（循环/非循环）、生物固氮、自生/共生/联合固氮菌2、微生物代谢的特点是什么？3、什么是发酵？什么是呼吸？两者有什么主要区别？4、葡萄糖降解主要有几条途径？5、试述同型乳酸发酵与异型乳酸发酵之间的区别。,6、化能自养菌的能量代谢有什么特点？7、试述细菌固氮作用机理和必要条件。8、在化能异养微生物的生物氧化中，底物脱氢和产能途径主要有哪几条？9、试从狭义和广义两方面来说明发酵的概念。,第二章 微生物代谢的调节机制,代谢控制发酵课程,微生物的代谢错综复杂，参与代谢的物质多种多样，即使同一物质也会有不同
26、的代谢途径，而且各种物质的代谢之间存在着复杂的相互联系和相互影响。在长期进化过程中，微生物建立了一套严密、精确、灵敏的代谢调节体系，能严格控制代谢活动。微生物的代谢调节具有多系统、多层次的特点。本章主要讨论对酶的调节。微生物可以按照适应环境的需要调节酶的表达（即酶蛋白的合成）及调节酶的活性（即酶的激活或抑制）。,第一节 酶合成的调节,通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的，也是缓慢的。优点：通过阻止酶的过量合成，能够节约生物合成的原料和能量。酶合成的调节类型：酶的诱导、酶的阻遏。,一、酶的诱导 enzyme induction,按照酶合
27、成与环境影响的不同关系，分为两大类：组成酶Structural enzymes：细胞固有的酶，其合成与环境无关，在菌体内的含量相对稳定，如EMP有关的酶；诱导酶Inducible enzyme，只在环境中存在诱导剂时才开始合成，一旦环境中没有了诱导剂，合成就终止，如乳糖代谢有关的-半乳糖苷酶。该过程称为酶的诱导。,诱导酶与组成酶在本质上是相同的，区别在于酶合成体系受控制的程度不同。在微生物育种中，常采取诱变等手段使诱导酶转化成组成酶，以利于大量积累所需的代谢产物。诱导的生理作用是可以保证能量与氨基酸不浪费，不把它们用于合成那些暂时无用的酶上，只有在需要时细胞才迅速合成它们。,酶的诱导合成又可分
28、为两种：同时诱导：即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到E.coli培养基中后，可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成。顺序诱导：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。,几个术语,诱导作用：培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中其相应酶的合成速率。诱导酶：只有在其底物，即有诱导物存在时才被合成的酶。诱导物（inducer）：能引起诱导作用的化合物，可以是底物，也可以是底物的衍生物，甚至是产物。安慰诱导物（gratuitors）：酶底物的结构
29、类似物常是出色的诱导物，但它们不能作为底物被酶转化。,1.1 操纵子学说转录水平调节,Monod和Jacob（1961）提出了操纵子（Operon）学说用于解释酶的诱导机制。大肠杆菌乳糖操纵子是第一个被发现的操纵子。所谓操纵子（元）是指结构上、功能上协同作用的相关基因组成的一个片段（区域）。操纵子假说认为：编码一系列功能相关的酶的基因在染色体中紧密排列在一起，且它们的表达与关闭是通过同一控制点协同进行的。,每个操纵子（元）至少由4个基因（部分）组成：（1）调节基因（Regulatory gene) ：编码组成型调节蛋白的基因；（2）操纵基因（Operator gene）：位于启动基因和结构基因
30、之间的一段碱基顺序，能与阻遏物（一种调节蛋白）结合，以此来决定结构基因的转录能否进行；（3）结构基因（Structural gene）：决定某一多肽的DNA模板，可根据其上的碱基顺序转录出对应的mRNA，再通过核糖体翻译出相应的酶蛋白；（4）启动基因（Promoter gene）：能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，即使RNA聚合酶的结合部位，也是转录的起始点。,（1）调节基因（Regulatory gene),它能编码调节（阻遏）蛋白，是一类变构蛋白，有2个特殊位点，一可与操纵基因结合，另一可与效应物结合，并发生变构作用，相应的提高或降低与操纵基因的结合能力。现发现有两种调节蛋白
31、： 1. 负作用调节蛋白在没有诱导物时能与操纵基因结合，阻止RNA多聚酶接近启动基因或操纵基因，也称为阻遏物（repressor）。 2. 正作用调节蛋白与启动子或启动子附近的DNA结合，能起增强RNA多聚酶与该启动子结合的效应。此种调节蛋白也称为激活因子（actiration）。,（2）操纵基因（Operator gene）,它能控制决定蛋白质（酶）的氨基酸顺序的一整套结构基因的转录，而操纵基因可受调节基因产生的阻遏物所阻遏，许多情况下，单个操纵基因可以控制一个或多个结构基因。,（3）结构基因（Structural gene）,是指在操纵基因邻近（一般在下游处）存在一个或多个基因，它编码不起
32、调控转录作用的蛋白质，如酶、膜蛋白和核糖体等。一部分结构基因的mRNA合成速度精确地被控制，但许多结构基因以一种（或多或少）不变的速度持续地转录DNA上的遗传信息，生成相应的mRNA进而转译成特定的酶（蛋白质）。,（4）启动基因（Promoter gene）,启动子（基因）含有两个和RNA聚合酶结合的顺序，一个集中在RNA聚合酶起始位置前约10个碱基对，另一个则集中在这个位置前35个碱基对，当RNA聚合酶与启动子接触并结合上去，mRNA合成即开始。 如阻遏物（阻遏调节蛋白）与操纵基因结合，则RNA聚合酶就不能和操纵基因结合，不能向前移动，也就不能转录出互补于结构基因的DNA顺序的mRNA，也就
33、没有酶的生成。但在E.coli中启动子必须经过cAMP受体蛋白复合物的激活后，才能启动。 这些基因形成整套调节控制机制，才能使生命系统在功能上有序、有效及开放。,1.2 乳糖操纵子（lac operon）酶合成的负调控诱导,调控机制,酶合成的正调节诱导大肠杆菌的麦芽糖操纵子,1.3 阿拉伯糖操纵子（arabinose operon）,一、Ara操纵子模型1、Ara操纵子的结构基因在葡萄糖缺乏时，阿拉伯糖是另一个可以为大肠杆菌提供碳源的五碳糖，在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因。araB基因编码核酮糖激酶；araA基因编码L-阿拉伯糖异构酶；araD基因编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构
34、酶以上3种酶能将Ara分解为大肠杆菌能利用的木酮糖。,2、Ara操纵子的结构 与araB、araA和araD这3个结构基因相邻的是一个复合启动子区和一个调节基因C，由调节基因C合成的AraC蛋白是一个自我调节蛋白（autoregulated protein），它既是ara操纵子的正调节蛋白，又是负调节蛋白。 复合启动子区主要有： PBAD区：Ara BAD启动子区 AraC位点：C蛋白阿拉伯糖复合物与操纵子结合区 -280区：C蛋白与操纵子结合区,二、AraC蛋白的正、负调节作用1、AraC蛋白的正调节作用正调节蛋白是激活蛋白，它存在时，结构基因表达。在阿拉伯糖存在时，AraC蛋白与其形成C蛋
35、白阿拉伯糖复合物，复合物与启动子区的AraC位点结合，激活PBAD，活化RNA聚合酶，使结构基因mRNA正常转录，产生上述3种酶，完成调控。,2、AraC蛋白的负调节作用没有阿拉伯糖时，AraC蛋白同时与AraC位点及远距离的-280区结合，造成DNA链的扭曲，不能起始mRNA的转录。,酶诱导物的种类：可分3类,胰蛋白酶,1.4 诱导调节的克服,只有需要时才合成所需的酶是微生物应有的、正常的调节机制。如果要使所需要的诱导酶大量生产，可采用诱变方法，借强力因素诱变引起的突变，消除诱导酶，跨越必需依赖诱导物这种障碍。如突变不是发生在结构基因上，而是发生在调节基因或操纵基因上，从而导致调节基因编码的
36、阻遏物（阻遏蛋白）无活性，或操纵基因对活性阻遏物的亲和力衰退，则无需诱导物便能产生诱导酶。这种突变作用称为调节性或组成型突变。具有这种特性的菌株称为组成型突变株。,组成型突变株的富集方法,1、在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选,恒化器：一种微生物连续培养器。它以恒定的速度流出培养液，使容器中的微生物生长繁殖始终低于最快生长速度。这种容器反映的是培养基的化学环境恒定。,一亲株经诱变的群体，生长在含有很低浓度的诱导物的恒化器中，有利于不需诱导物的组成型突变株的生长。那些由于诱导物浓度很低而生长缓慢的亲株被恒化器逐渐淘汰。恒化器起到一种富集组成型突变株的作用。如大肠杆菌在低浓度乳糖的恒化器中生长，就
37、可以筛选出没有诱导物存在也能生产-半乳糖苷酶的组成型突变株。,2、将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养,在第一个生长周期在含葡萄糖的培养基中极少量的组成型突变株与占绝对优势的亲株将以同样的速率生长。然后，将此混合培养物移种到乳糖为唯一碳源的培养基中，有利于突变株的生长；未突变的亲株需诱导半乳糖苷酶的合成，经较长的停滞期才开始生长。每次移种到含有葡萄糖的培养基后会使亲株的-半乳糖苷酶合成立即停止。再移种到含乳糖的培养基中亲株又需经一段停滞期后才能开始生长，因此反复交替上述培养过程，最终会使组成型突变株占优势。,3.使用诱导性能很差的基质,将经诱变的群体生长在一种能作为碳源，不能作为诱导物或其诱
38、导性能很差的基质上，可筛选出组成型突变株。如，用苯-半乳糖苷与2-硝基苯-L-阿拉伯糖苷可筛选出大肠杆菌组成型的-半乳糖苷酶的突变株。,4.使用阻碍诱导作用的抑制剂,有些化合物会阻扰酶的诱导作用。如，氰乙酰胺抑制绿脓杆菌酰胺酶的诱导合成；2-硝基苯-墨角藻糖苷抑制大肠杆菌诱导-半乳糖苷酶的合成。让细胞生长在含有诱导物和诱导抑制剂的培养基中生长，只有那些不需要诱导物的突变株才能生长。,5.提高筛选效率的方法,诱变后的菌群中组成突变株一般只占10-9- 10-6个，经上述的方法富集后数量可提高103倍，那么它们在菌群中的相对数量提高到10-6-10-3个，要从一千个菌中找出1个突变株也不是轻而易举
39、的事。如何将少数的组成型突变株在琼脂培养基平板上显形再提高筛选效率呢？,要使少数的组成型突变株在琼脂培养基上显形，可采用下面的方法。要筛选-半乳糖苷酶组成型突变株，可通过富集过的培养物铺在以甘油为碳源的琼脂平板培养基上，待菌落长成后，在平板上喷洒邻硝基酚-半乳糖苷，在没有诱导物下，只有组成型突变株能产生-半乳糖苷酶，能将邻硝基酚-半乳糖苷水解，生成黄色的邻硝基酚。在众多白色亲株菌落中，出现一个或数个黄色所需菌落很容易察觉。,二、酶的阻遏,在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成
40、。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏（色氨酸操纵子）和分解代谢产物阻遏。,2.1 末端代谢产物阻遏（end-product repression）,指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏，例如精氨酸的生物合成途径。,对分支代谢途径来说，情况就较复杂。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”受所有分支途径末端产物的阻遏，此即称多价阻遏作用（multivalent repression）。也就是说，任何单独一种末端产
41、物的存在，都没有影响，只有当所有末端产物都同时存在时，才能发挥出阻遏功能。典型的例子芳香族氨基酸、天冬氨酸族和丙酮酸族氨基酸的生物合成中的反馈阻遏。末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用，它可保证细胞内各种物质维持适当的浓度。,有些操纵子编码的酶参与降解化合物获得分解代谢产物和能量以构成细胞生长所需的其它分子，称为降解操纵子；另一些操纵子编码的酶催化合成细胞所需的化合物，如核苷酸、氨基酸、维生素等，这些操纵子成为合成操纵子。 生物合成操纵子也受阻遏物的负调控。能与阻遏物蛋白结合并使其结合于操纵基因的效应物成为辅阻遏物；调节基因编码的阻遏物（蛋白）不结合辅阻遏物就没有阻遏活性，没有阻遏活性的阻遏
42、物（蛋白）称脱阻遏物（蛋白），目前统称为阻遏物蛋白，一旦阻遏物蛋白与辅阻遏物结合，就能结合到操纵基因上，这时就称它为阻遏物。,色氨酸操纵子（Tryptophane operon）,氨基酸的合成也是由操纵子调节的，其基因表达一般都是可阻遏调节。1、色氨酸操纵子的结构 色氨酸的合成分5步完成，每个环节需要一种酶，而且编码这5种酶的基因是紧密连锁在一起的，即色氨酸操纵子的结构基因是由这5个基因组成的。 TrpE基因编码邻氨基苯甲酸合成酶；TrpD基因编码邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶;TrpC基因编码邻氨基苯甲酸异构酶；TrpB基因编码色氨酸合成酶；TrpA基因编码吲哚甘油-3-磷酸合成酶。,2、色氨酸操
43、纵子的调节基因,色氨酸操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远，其基因产物被称为辅阻遏蛋白。Trp操纵子的转录调控除了阻遏系统外，还存在弱化系统，使色氨酸的合成达到微细水平调控。,3、Trp操纵子的阻遏状态培养基中色氨酸浓度高时，trpR基因的产物辅阻遏蛋白+色氨酸有活性的阻遏物与trp操纵基因结合阻止结构基因表达,4、Trp操纵子的激活状态培养基中色氨酸浓度低时，trpR基因的产物辅阻遏蛋白不能与trp操纵基因结合有活性的操作区结构基因能够表达,在没有末端产物的情况下，阻遏蛋白不能与辅阻遏物（如色氨酸）结合成完全阻遏物，因此操纵基因的“开关”是打开的，这时转录、翻译可正常
44、进行，诱导合成酶大量转录翻译合成；反之，阻遏蛋白可与辅阻遏物结合成一个有活性的完全阻遏物，它与操纵基因相结合，使转录的“开关”关闭，从而无法进行转录和转译。,弱化作用（attenuation） 次级基因表达调控机制,随着对trp的深入研究，发现有些现象与以阻遏作为唯一调节机制的观点不相一致。在缺乏色氨酸的状态下，trp的转录速率是在有色氨酸存在的状态下的600倍。但阻遏物失活的突变不能完全消除色氨酸对trp operon表达的影响，没有阻遏物时，在培养基中含或不含色氨酸的条件下观察到转录速度相差8-10倍。,这种色氨酸操纵子表达产物的减少是由于弱化作用(attenuation)所造成的，即色氨
45、酸操纵子在第二水平上的调控。 弱化机制的加入使基因表达调控达到更高一级的水平。 在第一个基因(trpE)的前面5端有一个长162bp的序列，称为前导序列(leadersequence)或前导区(leader region)。当此序列发生部分缺失或突变时trp基因表达可提高6000倍。这个前导区称为弱化区，所表达出来的前导肽称为弱化子 (attenuator) 。,弱化子实际上是一个转录暂停信号。弱化作用就是通过一个位于mRNA前导序列末端的位点控制转录终止来实现的，只有当负责搬运Trp的tRNA-Trp存在时才会发生这种操纵子转录的提早终止(premature termination)。当发生
46、这种提早终止(或叫弱化作用)的时候，RNA聚合酶往往不能通过弱化子序列，而只产生一个140bp左右的核苷酸片段。,弱化的作用的调控实质是以翻译手段来控制基因的转录。,34茎-环（发夹）是不依赖转录因子终止信号的一部份，是一段富含G/C的回文序列，可以形成发夹结构，当这种结构形成时，使得RNA聚合酶终止转录。,阻遏作用和弱化作用的区别与协调,细菌通过弱化作用辅助了阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始了的转录，则只能通过弱化作用使它中途停顿下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，而弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA，它通过前导肽的翻译来控制转录的进行。 到目前为止
47、，已在大肠杆菌中，鼠伤寒沙门氏菌中发现Thr、Ile、Val、Trp、Lea、Phe、His等7种氨基酸合成过程中都存在这种弱化作用机制。在细菌细胞内这两种方式的协同作用，体现了生物体内精密、高效的基因表达调控。,那么细菌中为什么需要弱化子调控系统呢？其原因可能是： a.阻遏物从有活性到无活性的转变速度极 低，需要有一个能更快地做出反应的系统来维持适当氨基酸的水平。 b.弱化子系统主要是对外源氨基酸（色氨酸）浓度作出反应。例如：外源氨基酸（色氨酸）浓度很低的信号，虽然足以引起Trp操纵子去阻遏作用。但这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成。于是在环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加Trp基
48、因表达，从而提高内源色氨酸的浓度。,为什么还要阻遏体系呢？ 没有阻遏体系，似乎只有弱化作用也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为当有大量外源色氨酸存在时，通过阻遏体系阻止非必须的先导mRNA合成，使合成更加经济。 当然His操纵子中，没有阻遏体系，只有弱化子调节。说明弱化子的调节作用是控制转录的终止，控制转录精细，是阻遏调控体系的次级调节。,2.2 分解代谢物阻遏（catabolitic repression）,指细胞内同时有两种可利用底物（碳源或氮源）存在时，利用快的底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。这种阻遏不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引
49、起的。也就是在代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。,1942年，Monod将E.coli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，发现该菌可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就产生了在两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象” 。其原因是，葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成。这一现象又称葡萄糖效应。后来发现葡萄糖不仅对乳糖降解酶合成阻遏，而且对好几条降解途径的酶系，如山梨糖醇、木糖醇、阿拉伯糖、甘油等途径的酶合成发生阻遏。,由于这类现象在其他代谢中（例如铵离子的存在可阻遏微生物对精氨酸的利用等）的普遍存在，1961年Magas
50、anik将其统称为分解代谢物阻遏。 这种阻遏对微生物是很有利的，只要有一个容易同化的底物存在，细胞就不必耗费能量去合成效率较低的途径的酶系，而使其代谢作用能更多地用于产生生长所必需的成分，是微生物细胞经济的一个方面。,1、 cAMP是对酶合成水平的控制正调节,2.2.1 分解代谢物阻遏的机制,乳糖操纵子的启动基因P包含两个位点：A， RNA聚合酶结合的位点；B，CAP-cAMP复合物结合位点。CAP是降解物基因活化蛋白（又称为cAMP受体蛋白，CRP）。在只含有乳糖的培养环境中，转录开始时，cAMP先与CAP结合生成cAMP-CAP复合物，该复合物能与乳糖操纵子中的启动子的CAP结合位点结合，
