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1、临床病原学实验诊断,北京中医药大学东直门医院检验科 姚兴伟,1,主要内容,2,1 概念 病原体指可造成人或动物感染疾病的微生物（包括细菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、寄生虫）。凡是由病原微生物引起的疾病统称为感染性疾病。,一、概述,3,2 临床微生物检查的任务（1）为临床提供快速、准确的病原学诊断。（2）指导临床合理使用抗生素。（3）对医院感染进行监控。,一、概述,4,3 临床微生物学检查的程序,一、概述,5,采集标本是病原学实验诊断的第一步，留取标本的质量关系到实验诊断的结果正确与否。,Garbage in,garbage out!,二、标本采集和运送,6,（一）呼吸道标本 鼻/咽拭
2、子、痰、通过气管收集的标本均可作为呼吸道标本。1.送检指征（1）上呼吸道标本病毒性普通感冒伴有明显咽痛时，怀疑为咽部链球菌感染，应做细菌培养。细菌性咽扁桃体炎：明显咽痛、畏寒、发热，体温可达39以上。（2）下呼吸道标本咳嗽、咳痰。咯血、呼吸困难。发热。胸痛。,二、标本采集和运送,7,2.采集注意事项（1）用药前采集（2）晨起为宜（3）清洁口腔（4）咳深部痰注：作结核分枝杆菌检查，痰量要多或留取24小时痰液，以提高阳性检出率。,二、标本采集和运送,8,3.标本采集方法（1）鼻、咽拭子：鼻拭子：让病人头部自然放松，将拭子贴鼻孔壁慢慢转动进入病人一鼻孔内，至鼻腭处，然后边擦拭边旋转慢慢取出。以同一拭
3、子，用同样的方法擦拭另一鼻孔。咽拭子：嘱患者用清水反复漱口，让病人头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，手持拭子在病人两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次。,二、标本采集和运送,9,二、标本采集和运送,（2）下呼吸道标本(1)自然咳痰法(2)气管吸出物（气管插管患者） (3)支气管镜采集法支气管肺泡灌洗液防污染毛刷采集,10,痰标本镜下分类,注：A、B两种情况的痰标本适合做培养，C级标本为不合格标本，应重新留取！,二、标本采集和运送,11,二、标本采集和运送,鳞状上皮细胞25个/每低倍视野,合格,12,二、标本采集和运送,鳞状上皮细胞25个/每低倍视
4、野 白细胞10个/每低倍视野,不合格,13,二、标本采集和运送,胞内细菌提示感染,14,二、标本采集和运送,15,二、标本采集和运送,16,二、标本采集和运送,17,3.痰标本中主要正常菌群和致病菌,二、标本采集和运送,18,（二）血液标本1.送检指征 患者出现以下一种或同时具备几种临床表现时可作为血培养的重要指征：,二、标本采集和运送,(6)皮肤、黏膜出血；(7)昏迷；(8)多器官衰竭；(9)血压降低；(10)呼吸加快（呼吸率20/分或CO2分压32mmHg）；,(1)发热（38）或低温（36）；(2)寒战；(3)白细胞增多（10.0109/ L，特别是有“核左移”时）；(4)粒细胞减少（1
5、.0 109/ L）；(5)血小板减少；,其他：肝脾肿大；关节疼痛；C反应蛋白、内毒素、降钙素原升高等。老年菌血症患者可能不发热或体温不低，如伴有身体不适、肌痛，可能是感染性心内膜炎的重要指征。,19,2.注意事项（1）尽量在抗菌药物使用前采集血标本作培养，如已用抗菌药物治疗者则在下次用药前采集。（2）对间歇性寒战或发热者应在寒战或体温高峰到来之前0.5-1小时采集。（3）采样以无菌法由不同穿刺点采集2-3套(每套包括一个需氧瓶和一个厌氧瓶)，成人每次8-10ml/瓶，婴儿和儿童1-2ml/瓶。（4）血培养抽取后，立即送到微生物实验室，如不能及时送检，可放置在室温或35-37孵箱保存。（切勿放
6、置在4 冰箱）,二、标本采集和运送,20,二、标本采集和运送,21,2.注意事项（1）尽量在抗菌药物使用前采集血标本作培养，如已用抗菌药物治疗者则在下次用药前采集。（2）对间歇性寒战或发热者应在寒战或体温高峰到来之前0.5-1小时采集。（3）采样以无菌法由不同穿刺点采集2-3套(每套包括一个需氧瓶和一个厌氧瓶)，成人每次8-10ml/瓶，婴儿和儿童1-2ml/瓶。（4）血培养抽取后，立即送到微生物实验室，如不能及时送检，可放置在室温或35-37孵箱保存。（切勿放置在4 冰箱）,二、标本采集和运送,22,临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards I
7、nstitute,CLSI）要求每次从不同穿刺点采集2-3套标本，每套应包括一个需氧培养瓶，一个厌氧培养瓶。成年病人不能只采1瓶血培养标本，采血量不足和只做1套血培养所得的结果是很难正确解释的。Cockrill2004年报告:163位病人,血培养仪,二、标本采集和运送,23,7072份血培养，640份阳性，阳性率为9,二、标本采集和运送,24,出现阳性时间： 厌氧瓶有5%比需氧瓶早1天报告结果。因此,只做需氧菌不做厌氧菌培养,将有19%的菌株不能发现,另有5%的血培养延迟1天报告阳性结果。,二、标本采集和运送,25,2.注意事项（1）尽量在抗菌药物使用前采集血标本作培养，如已用抗菌药物治疗者则
8、在下次用药前采集。（2）对间歇性寒战或发热者应在寒战或体温高峰到来之前0.5-1小时采集。（3）采样以无菌法由不同穿刺点采集2-3套(每套包括一个需氧瓶和一个厌氧瓶)，成人每次8-10ml/瓶，婴儿和儿童1-2ml/瓶。（4）血培养抽取后，立即送到微生物实验室，如不能及时送检，可放置在室温或35-37孵箱保存。（切勿放置在4 冰箱）,二、标本采集和运送,26,3.血液中可能感染的细菌革兰氏阳性球菌： 金黄色葡萄球菌，其次为凝固酶阴性葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等；-溶血性链球菌以及厌氧球菌。革兰氏阴性杆菌： 铜绿假单胞菌及其他非发酵菌；肠杆菌科细菌；拟杆菌、梭杆菌等。,二、标本采集和运送,27,
9、（三）脑脊液与其他无菌体液标本1.适应症成人一般表现为发热、头疼、恶心、呕吐、颈项强直和反射增强；婴儿和新生儿为不明确和无特异性，对婴儿不明原因的发热，应怀疑为脑膜炎。这种情况下建议检查脑脊液。2.标本采集由临床医生以无菌方法做腰椎穿刺，抽取脑脊液3-5ml，盛于无菌容器中送检。脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶酶，迅速自溶，肺炎链球菌及流感嗜血杆菌离体后也易死亡。因此，脑脊液无论涂片或培养，必须于采集后立即送检。,二、标本采集和运送,28,二、标本采集和运送,（三）脑脊液与其他无菌体液标本3.引起脑膜炎的病原体 脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等。因其抵抗力弱，不耐冷、容易死亡，故采集的脑脊
10、液应立即保温送检或床边接种。4.胸水、腹水和心包液等因标本含菌量少，宜采集较大量标本送检以保证检出率。,29,（四）尿液标本1.送检指征（1）典型的尿路感染。（2）肉眼脓尿或血尿。（3）尿常规亚硝酸盐阳性或有白细胞。（4）不明原因的发热，无其他局部症状。（5）留置导尿管的患者出现发热。（6）尿道口有脓性分泌物。（7）泌尿系疾病手术前。,二、标本采集和运送,30,2.注意事项(1)多数药物均通过尿液排泄，因此采集尿液应在用药前进行。 (2)严格进行无菌操作，因为尿液标本的采集和培养中最大的问题是污染杂菌。(3)通常应取晨起第一次尿液送检。(4)常用清洁中段尿作为送检标本。排尿困难者可导尿，但应避
11、免多次导尿所致尿路感染。,二、标本采集和运送,31,3.可能的致病菌（1）阴性菌：肠杆菌科细菌（大肠埃希菌、克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌属等）。（2）阳性菌：肠球菌属等。（3）酵母样真菌。,二、标本采集和运送,32,4.结果分析（1）革兰阴性杆菌105CFU/ml，革兰氏阳性球菌菌落计数 104CFU/ml时，有诊断意义。（2）培养出104-105CFU/ml的细菌时，需要根据患者的临床表现进行评估。（3）当培养出小于104CFU/ml的细菌时，通常认为是标本污染。注：CFU菌落生长单位（菌落数）,二、标本采集和运送,33,（五）创面分泌物、脓性标本1.用药前采集标本，严格无菌采样
12、。2.采集部位首先应清除污物，消毒皮肤，开放性脓肿和脓性分泌物先以无菌盐水冲洗溃疡表面防止表面污染菌混入标本影响检测结果。3.开放性脓肿，用无菌拭子采取脓液及病灶深部分泌物。用2支无菌拭子拭取溃疡深处的分泌物后插入无菌试管送检。一支为涂片检查用，另一支作培养用。,二、标本采集和运送,34,二、标本采集和运送,4.封闭性脓肿，以无菌干燥注射器穿刺抽取，将脓液注入无菌容器内送检。5.疑为厌氧菌感染者，取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检，否则标本接触空气导致厌氧菌死亡而降低临床分离率。6.大面积烧伤的创面分泌物 用无菌拭子采集多个部位创面的脓液或分泌物，置无菌试管内送检。注：由于烧
13、伤的早期创面是无菌的，经过12小时才可出现大量细菌，因此在烧伤后12小时内，勿采集创面的标本，否则不能获得阳性结果。7.不能立即送检的标本，应放4保存。（培养淋球菌、脑膜炎奈瑟菌的标本除外 ） 8.常见致病菌：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等。,35,（六） 粪便标本1.取含脓、血或粘液粪便置于清洁容器中尽快送检（2小时）。2.由于粪便中含有种类繁多正常菌群，通常使用选择培养基分离致病菌。3.一次粪便培养阴性不能完全排除胃肠道病原菌的存在，对于传染性腹泻患者需三次送检粪便进行细菌培养。,二、标本采集和运送,36,小结采集标本最好能在用药前采样，以提高阳性率 。采集标本时必须注意无菌操作，使用密闭
14、的无菌容器，避免污染杂菌 。采集标本后应尽快送检，否则病原菌会死亡而影响细菌检查的正确性 。采集的标本中不得加防腐剂或消毒剂。,二、标本采集和运送,37,二、标本采集和运送,38,1 形态学检查及作用（1）包括不染色标本检查法和染色标本检查法。（2）镜检可以了解有无细菌及大致的菌量。（3）根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类。（4）通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。,三、细菌的形态学检查,39,2不染色标本（1）细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。（2） 有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位
15、移。 无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。（3）有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定。 如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似流星状运动的细菌，制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。,三、细菌的形态学检查,40,3 染色标本（1）革兰染色 临床上常用的普通细菌染色方法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。,三、细菌的形态学检查,41,三、细菌的形态学检查,革兰阳性菌,42,三、细菌的形态学检查,革兰阳性菌,43,三、细菌的形态学检查,革兰阴性菌,44,三、细菌的形态学检查,革兰阴性菌,45,三、细菌的形态学检查,真菌
16、,46,三、细菌的形态学检查,真菌,47,三、细菌的形态学检查,（2）抗酸染色,48,（2）抗酸染色,三、细菌的形态学检查,49,（3）荧光染色荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。,三、细菌的形态学检查,50,（4）墨汁染色 一般用于新型隐球菌检查。,三、细菌的形态学检查,51,（5）六胺银染色用于卡氏肺孢子菌检查,三、细菌的形态学检查,52,1 细菌分离、培养和鉴定的目的（1）明确感染病原体。（2）为临床提供体外抗微生物药物敏感试验纯化菌。,四、细菌的分离、培养和鉴定,53,2 常
17、用培养基的种类（1）基础培养基：牛肉浸液加入蛋白胨、氯化钠、磷酸盐、琼脂等。,四、细菌的分离、培养和鉴定,54,（2）增菌培养基：增菌肉汤、血培养。,四、细菌的分离、培养和鉴定,55,（3）营养培养基：血平板、巧克力平板。,四、细菌的分离、培养和鉴定,56,（4）选择培养基：SS（Salmonella Shigella）平板、XLD(木糖赖氨酸脱氧胆盐)平板。,四、细菌的分离、培养和鉴定,57,（5）鉴别培养基：显色培养基。,四、细菌的分离、培养和鉴定,58,3 培养方式（1）需氧培养（2）厌氧培养（3）二氧化碳培养（5%CO2）（4）培养时间：16-20小时,四、细菌的分离、培养和鉴定,59
18、,1 药物敏感性实验的目的（1）预测抗菌治疗的效果。（2）进行细菌耐药性监测。（3）根据细菌对各种抗菌药物的敏感谱，对被测菌株进行鉴定。,五、药物敏感性实验,60,2 抗菌药物的种类,五、药物敏感性实验,61,五、药物敏感性实验,核糖体,mRNA,62,4 结果判读敏感 S（Susceptible） 由被测细菌引起的感染，除禁忌症外，可用该抗菌药物常用推荐剂量通过适当治疗而达到治疗目的。中介 I（Intermediate） 被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组织液中通常可达到的浓度，而治疗反应率可能低于敏感菌株。中介意味着药物可通过提高剂量或在药物被生理性浓集的部位发挥临床效力。耐药 R（R
19、esistance）被测菌株不能被该抗生素的常用剂量在组织内或血液中达到的浓度所抑制和/或被测菌的MIC落在某些范围内，提示该菌可能存在特定耐药机制，而且治疗研究表明其临床疗效不可靠。,五、药物敏感性实验,63,5 抗生素分类（根据对微生物的作用方式）类繁殖期杀菌剂：包括青霉素类、头孢菌素类、糖肽类。类静止期杀菌剂：主要是氨基糖苷类抗生素，如链霉素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素及丁胺卡那霉素。类速效抑菌剂：主要包括氯霉素、红霉素、林可霉素及四环素类。类慢效抑菌剂：包括甲氧苄氨嘧啶(TMP)、二甲氧苄氨嘧啶(DVD)、磺胺类等。,五、药物敏感性实验,64,6 联合用药的指征（1）病因未明而又危及生
20、命的严重感染。（心内膜炎、败血症）（2）混合感染。（严重的创伤、烧伤、产后感染、异物性肺炎）（3）减少耐药菌产生。（结核病、慢性尿路感染等）,五、药物敏感性实验,65,7 联合用药的结果（1）协同作用:两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。（ABA+B）（2）相加作用:两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和。 （AB=A+B） （3）无关作用:两种药物联合作用的活性等于其单独活性。(A=B)（4）拮抗作用:两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性。(ABB AB),五、药物敏感性实验,协同 相加 无关 拮抗,66,8 抗生素联合应用的效果（1）+ 协同或相加作用。 （2）+ 拮抗作用
21、。（3）+ 无关作用。（4）+ 协同或相加作用。 （5）+协同或相加作用。（6）+相加作用。类繁殖期杀菌剂类静止期杀菌剂类速效抑菌剂类慢效抑菌剂,五、药物敏感性实验,协同 相加 无关 拮抗,67,六、细菌的耐药性,1 细菌耐药性 细菌耐药性又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性。 耐药性根据其发生原因可分为天然耐药性和获得耐药性。前者是染色体DNA突变而致，后者往往是质粒、噬菌体及其他遗传物质携带外来DNA片段导致产生的耐药性。,68,2 细菌耐药性机制（1）产生针对抗生素的灭活酶和钝化酶：-内酰胺酶、超广谱-内酰胺酶氨基糖苷类产生钝化酶其他酶类：金属酶等（2）抗生素作用的靶位改变：MR
22、SA（3）改变细菌外膜通透性：铜绿假单胞菌的亚胺培南通道蛋白OprD缺失后可导致耐药。（4）主动流出系统：细菌可以将进入菌体内的药物泵出体外。注：细菌的耐药机制往往不是单个存在的！,六、细菌的耐药性,69,3 当前关注的耐药问题（1）革兰阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）。耐万古霉素肠球菌（VRE）。耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）。（2）革兰阴性菌产ESBLs肠杆菌科细菌：大肠埃希菌、克雷伯菌、奇异变形杆菌。产AmpC酶肠杆菌科细菌：阴沟肠杆菌。多重耐药的铜绿假单胞菌、不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。,六、细菌的耐药性,70
23、,4 MRSA的耐药机制、耐药性及治疗原则（1）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的主要耐药机制是产生青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白和-内酰胺类抗生素的亲和力降低，导致细菌耐药。（2）mecA 基因是PBP2a的编码基因。（3）MRSA几乎对所有的-内酰胺类抗菌药物耐药。（4）目前，首选万古霉素。,六、细菌的耐药性,71,5 ESBLs的耐药性和治疗原则（1）ESBL（Extended-spectrum-lactamases ）超广谱-内酰胺酶 。（2）主要的产酶细菌：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌。,六、细菌的耐药性,72,（3）青霉素类、头孢类、氨曲南耐药，碳青
24、霉烯类、 内酰胺/酶抑制剂、头霉素类可能敏感。（4）用药原则: 碳青霉烯类抗生素是治疗产ESBLs菌感染的首选药物。但国内外已有报道指出，已经分离出耐碳青霉烯类的肠杆菌科细菌，这可能由于碳青霉烯类抗菌药的广泛应用，造成其耐药菌株逐渐产生。,六、细菌的耐药性,73,6 耐药性监测的意义（1）指导临床合理使用抗菌药物，防止滥用抗生素，延缓细菌耐药性发生。（2）有助于预防、控制和遏制本地的、地区的以及全国的耐药性发生发展。（3）帮助制定修订经验处理和标准化的用药指南，为修订国家药典提供信息。（4）为研制新的抗菌药物和改造老抗菌药物提供信息。,六、细菌的耐药性,74,1 医院感染的概念医院感染或医院获
25、得性感染是指病人在入院时既不存在、亦不处于潜伏期，而在住院期间获得的感染，包括在医院内获得而于出院后发生的感染。,七、医院感染与管理,75,2 医院感染的分类和条件（1） 医院感染按其感染来源分为内源性感染和外源性感染两种。（2）病原体是内源性感染和外源性感染的共同的必备条件， 但外源性感染还必须具备：感染源。传播途径：直接接触传播、间接接触传播、空气传播、共同媒介传播、生物媒介传播。易感宿主。,七、医院感染与管理,76,3 医院感染的常见致病菌（1）革兰阳性球菌：金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和链球菌。（2）革兰阴性杆菌：大肠埃希菌、克雷伯菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌等。（3）近来医院感染的病原体特点：正常菌群致病增多，新的病原体不断出现。,七、医院感染与管理,77,4 医院感染的预防与控制措施（1）对具有潜在感染的标本实施严格处理。（2）对各种医疗器具统一消毒、灭菌处理。（3）双向防护应成为常规。（4）加强实验室生物安全管理。（5）成立医院感染管理机构。,七、医院感染与管理,78,复习要点,79,The end,80,
