兽药残留检测课件.ppt

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1、食品中兽药残留量的分析,第一节 概 述,使用兽药的目的,兽药的主要用途有：防病治病、促进生长、提高饲料利用率、改善动物性食品的品质等。,兽药和兽药残留,兽药：预防和治疗畜禽疾病的药物；促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质；也包括一些化学的、生物的动物保健品或饲料添加剂。兽药残留：“兽药在动物性食品中的残留”的简称，是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药有关的杂质。,抗生素类：四环素、氯霉素、磺胺类、呋喃类等；-兴奋剂：盐酸克伦特罗、己烯雌酚、孕酮等；激素：己烯雌酚、孕酮等； 抗寄生虫类：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。,兽药残留的类型

2、,非法使用违禁或淘汰药物； 不遵守休药期规定； 滥用药物； 违背有关标签的规定； 屠宰前用药。,兽药残留产生的原因,兽药残留的来源,在食品动物体内或动物性食品中发现的违章残留,大都是由用药错误造成的,其原因主要有:不正确地应用药物,如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示,这些因素有可能延长药物残留在体内的时间,从而需要增加休药的天数;在休药期结束前屠宰动物;屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检查; 以未经批准药物作为添加剂饲喂动物;,药物标签上的用法指示不当,造成违章残留物;饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料;接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的废水和

3、排放的污水(如猪经常摄入这种污水);任意以抗生素药渣喂猪或其他食品动物等滥用抗生素,是出现抗生素残留的主要原因。,美国食品药物管理局(FDA)和美国兽医中心(CVM)的调查结果表明,引起违章药物残留的常见原因为:不遵守休药期;使用未经批准的药物;未做用药记录;饲料加工或运送错误;盛放它种药物的贮存容器未充分清洗干净等。,兽药残留:残留在动物性食品中兽药原形式、代谢物和杂质。,兽药分类：抗生素类：包括青霉素、链霉素、金霉素、土霉素、四环素、泰乐菌素等。呋喃药类：包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃呾啶等。磺胺药类：抗球虫药：激素药类：驱虫药类：,兽药残留的危害,毒性作用：急性、慢性、三致 耐药性：耐药菌

4、株传递给人 过敏反应：青霉素、磺胺类等 激素（样）作用：潜在致癌性、发育毒性（儿童性早熟）等 污染环境，影响生态：进入环境仍有活性,兽药残留限量标,90年代开始监控工作，2002最新动物性食品中最高残留限量：可用，不限量：88可用，需限量：94可用，不得检出9禁用，不得检出：31,我国食品中部分兽药的最高残留限量,兽药残留限量标准,兽药残留分析技术的特点待测物质浓度低样品基质复杂，干扰物质多兽药残留代谢产物多样或不明动物种类多样，对药物代谢存在差异,兽药残留的检验方法,对检测方法的要求快速高通量定量准确度和精确度确证,兽药残留的检验方法,理想的仪器装备样品经简单处理即可上机测定不需萃取和净化快

5、速、准确的定量分析自动的资料处理,分析方法的总体思路高水平(Level )方法确证和定量被分析物质 中等水平(Level )方法定量但不需要确证被分析物质低水平(Level )方法筛选,ELISA：简单、快速、灵敏度，但容易产生假阳性，一般只适用进行样品粗筛，阳性结果需进行确证。 GC：灵敏度较高，但大多数兽药极性或沸点偏高，需繁琐的衍生化步骤，限制了应用。HPLC：操作简单，但灵敏度不高；某些残留，检出限达不到要求。仪器联用：分离、定性、定量一体，灵敏、准确、选择性都高，是国际公认的确认方法。 GC/MS、LC/MS等,兽药残留的分析方法,筛选方法,检测和确认方法：理化检验技术（GC、HPL

6、C、TLC、GC-MS、HPLC-MS等）。,兽药残留的分析方法,兽药残留的检验分析方法包括筛选、检测和确认。,GC和GC-MS的区别,GC是指气相色谱仪。 一般来说 气象色谱仪使用的检测器 有npd fid fpd ecd等等如果气象色谱器没加上述常用检测器 而是用质谱当做检测器 那么就是GC-MS了，GC-MS一般指的是单级质谱 如果是二级质谱就是 GC-MS-MS了。GC就是一个分离装置 严格说 GC是没法单独用的 必须加检测器 只不过人们习惯吧 GC-FID 、GC-ECD、GC-FPD等等 简称为GC而已。,气相色谱检测器,热导检测器,氢火焰离子检测器,电子捕获检测器,火焰光度检测器

7、,质谱检测器,TCD thermal conductivity detector,FPD flame photometric detector,FID hydrogen flame ionization detector,MSD mass spectrum detector,ECD electron capture detector,质谱分析Mass Spectrometry，MS,质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质量m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱

8、。,质谱分析的过程与原理,23,1、进样化合物通过汽化引入离子化室；,2、离子化在离子化室，组分分子被一束加速电子碰撞（能量约70eV），撞击使分子电离形成正离子；M M+ + e或与电子结合，形成负离子M + e M,24,25,5、加速离子进入一个强度为H的磁场，发生偏转，半径为：,不同的物质有不同的质量谱质谱，利用这一性质，可以进行定性分析（包括分子质量和相关结构信息）；谱峰强度也与它代表的化合物含量有关，可以用于定量分析。,化合物C5H12O的质谱图,GC-MS的基本流程,GC-MS联用的优缺点,色谱仪有很强的分离混合物的能力，但是对化合物定性的能力差。质谱分析试样必须是高度纯净物，而

9、质谱本身无分离混合物的能力，但是能用来测定化合物的相对分子质量和化学结构，是一个优良的定性工具。,GC-MS联用的优缺点,气相色谱-质谱联用的时候，气相色谱法分离效能高，定量准确，故气相色谱仪是质谱法的理想分离器；同样，质谱法灵敏度高，定性能力强，几乎能检查出所有的有机化合物，故质谱仪是气相色谱法的理想检测器。气相色谱首先对挥发性的物质进行分离、定量；质谱法再通过测定离子质量和强度来进行成分分析和结构分析。因此，采用两者的联用，综合其优点，克服其不足。,兽药残留的检验方法,第二节 食品中抗生素类兽药残留检验,四环素类抗生素的残留检验 氯霉素类抗生素的残留检验 磺胺类兽药残留检验 硝基呋喃类兽药

10、残留检验,四环素类抗生素的残留检验,常用的四环素类四环素、土霉素、金霉素等允许使用，最高残留有限量 常用的测定方法HPLC、TLC、ELISA等,HPLC法测定四环素类兽药残留原理：样品提取，微孔滤膜过滤，反相色谱柱（ODS柱）分离，紫外检测器检测。样品处理：5%高氯酸提取、离心、过滤。测定时流动相中加入NaH2PO4，调节pH=2.5，可改善分离度及峰形。当pHpI时，蛋白质以阳离子形式存在，高氯酸与之沉淀，离心除去。,四环素类抗生素的残留检验,（A）空白养殖虾样品 （B）四种四环素类药物的养殖虾样品,定量方法：用系列标准品的浓度峰面积（峰高）绘制标准工作曲线，应该是一条通过原点的直线。,氯

11、霉素类抗生素的残留检验,常用的氯霉素类（CAPs）氯霉素、无味氯霉素、乙酰氯霉素、甲砜霉素、弗甲砜霉素骨髓细胞、肝细胞毒性禁用，不得检出 常用的测定方法GC、HPLC、LC-MS、ELISA等,气相色谱法原理：样品提取、净化、衍生化，毛细管气相色谱柱分离，电子捕获检测器检测。样品处理：乙氰提取、离心SPEC18柱净化-衍生化,氯霉素类抗生素的残留检验,氯霉素类抗生素的残留检验,LC-MS法检测（确认检验）原理：乙酸乙酯提取，浓缩后水解，固相萃取柱净化，LC-MS联用检测GB-T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定,磺胺类（SAs）兽药残留检验,常用的磺胺类兽药磺胺嘧啶、

12、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶对过敏反应者有致敏作用；积蓄有肝肾毒性；还可影响造血系统我国规定残留限量0.1mg/kg,磺胺类药物结构,基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺， 具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物,磺胺类药物的分子结构,磺胺类兽药残留检验,HPLC法测定磺胺类兽药残留（最常用）原理：乙腈提取，正己烷萃取除脂，加入正丙醇减压干燥，残留物用乙腈溶解，氧化铝柱净化，加入正丙醇，减压干燥，流动相溶解，HPLC紫外检测器检测。,磺胺类药物的HPLC法色谱条件,常用反相柱分离，有C18、C8或者C4柱，也用离子对色谱柱。磺胺类药物在色谱柱上的保留值不仅受流动相的极性影响，还会受磺胺类

13、药物的解离形式的影响，因此，流动相的pH值对色谱分离的效果起重要作用。,磺胺类药物的HPLC法色谱条件,流动相主要由乙睛-水，甲醇-水或者乙睛-甲醇-水按不同比例组成，文献采用乙醇-水系统。在以上流动相系统中加入适量乙酸或十二烷基磺酸钠（SDS）用于提高分离效率。,方法说明磺胺类最大吸收为260nm280nm，检测时选用=270nm。样品极性较强，70%乙腈的极性要大于95%乙腈，洗脱效果更好。净化时用碱性氧化铝。,硝基呋喃类（NFs）兽药残留检验,概述硝基呋喃类及其代谢物可使动物癌变和基因突变禁用，在动物性食品和饲料中不得检出常用ELISA、HPLC、LC-MS检测,HPLC法测定禽肉中呋喃

14、唑酮原理：样品与C18柱填料研磨，混合装柱，正己烷淋洗，乙酸乙酯洗脱，浓缩，溶解，氧化铝柱净化，检测方法说明基质固相分散技术,硝基呋喃类兽药残留检验,第三节盐酸克伦特罗残留的检验,概述 盐酸克伦特罗兽药残留的检验,20世纪70年代末,美国等发达国家进行了盐酸克伦特罗实用性开发研究工作,至80年代,盐酸克伦特罗作为饲料添加剂被广泛应用到畜禽生产中。1996年,我国一些大专院校、科研单位研究发现,盐酸克伦特罗对动物具有加强脂肪分解,促进蛋白质合成,实现动物营养再分配,提高胴体瘦肉率,加快动物生长等作用。养猪户在不改变管理模式、不增加饲料投入、不提高蛋白质的前提下,在育肥猪出栏前2530d投喂盐酸克

15、伦特罗,就能将瘦肉率提高10%,育肥增重提高10%12%,因此在畜牧业生产中被大量使用。,概 述,概 述,理化性质Clenbuterol，简称CLB，-兴奋剂溶解性：易溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。化学性质稳定：瘦肉精化学性质稳定，不易破坏。172开始分解，经260油煎5min才会破坏减半。口服后在胃肠吸收迅速，10-20min起效，2-3h血液浓度达到峰值，作用维持5h左右，半衰期25-39h，消除5个半衰期（约97%）需5-8d。易在动物眼睛、毛发、肝、肺、肾等组织中蓄积。我国食品中的限量：马、牛肌肉0.1g/kg，肝、肾0.5g/kg，牛奶0.05g/kg。,概述,药理性质和毒性

16、曾用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛后用于促进动物生长、提高瘦肉率人食用含CLB残留畜产品后的表现为危害肝脏和肾脏。长期摄入可致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。,概述,CLB检验、检疫现状1987年，欧盟、美国宣布禁止使用CLB作兽用饲料添加剂目前，欧盟成员国已将CLB残留作为肉品进口必检项目我国政府也于97年发文禁止在饲料中添加使用CLB,CLB残留量的检验,感官检测 健康肉暗红色，肉质弹性好，无“出汗”现象；“问题肉”特别鲜红，脂肪非常薄，瘦肉纤维疏松，有“出汗”现象。 ELISA法测定 特异性强、灵敏度高、酶标板上一次可作多份样品检测；快速筛选方法。,GC-MS测定法,原理：样品剪碎，高氯酸匀浆，

17、超声波加热提取，异丙醇-乙酸乙酯萃取，浓缩，弱阳离子交换柱分离，洗脱，浓缩后衍生化，测定,GC-MS测定法-样品处理,提取：肉样-高氯酸匀浆-超声波提取-水浴加热-冷却离心取上清-调PH9.50.1-氯化钠、异丙醇-乙酸乙酯提取-旋转水浴蒸发至近干-Na2H2PO4溶解-过滤- Na2H2PO4定容。,GC-MS测定法-样品处理,净化和浓缩：离子交换柱-洗脱液（乙醇-氨洗脱）-氮气浓缩至干。衍生化：甲醇溶解残渣-浓缩至干-衍生剂BSTFA-蒸干-甲苯定容，待用。标准系列同时衍生化。,GC-MS测定法-说明,1.肉要先绞碎成肉糜。2.该方法的检出限是0.5g/kg。3.0.1mol/L的高氯酸匀

18、浆，超声波萃取，离心，液-液萃取，效果好。4.加入NaCl，液-液萃取时可防止乳化。5.衍生化前先净化，可以避免杂质衍生化，干扰测定。,美托洛尔,HPLC测定法,原理：样品提取、净化，乙醇-氨洗脱后浓缩，流动相定容后HPLC测定样品处理：提取、净化浓缩同GC-MS，不需要衍生化。,HPLC测定法,方法说明：该方法适用于各种食品以及肝、肾等组织及汤汁中瘦肉精的测定。标准品要临用时新鲜配制，避光保存。除GC-MS和HPLC法外，还可用ELISA法进行筛选，再用上述方法确认。,酶联免疫法,基于抗原抗体反应竞争性抑制进行测定的。,GB/T 5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定第三

19、法GC/MS法。,基本原理：微孔板包被有针对克伦特罗IgG的抗抗体；加入克伦特罗抗体，经过温育和洗涤后；加入酶标记物、标准或样品溶液，克伦特罗与酶标记物竞争与抗体结合；没有连接的克伦特罗酶标记物在被洗涤除去；加入酶底物和发色剂并且温育，结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝色的产物，加入反应终止液使颜色有蓝转变为黄色。在450nm处比色测定。,酶联免疫法,竞争性酶联免疫吸附试验法测抗原的基本原理示意图,酶联免疫法,氯霉素检测试剂盒,组成：微量测试孔；氯霉素标准溶液；10倍浓缩萃取稀释液；10倍浓缩洗涤液；氯霉素酶标记物；底物溶液；反应终止液。,主要试剂：氯霉素酶联免疫检测试剂盒。,酶联免疫法,主要仪

20、器：简易的萃取设备、氮吹仪、离心机、酶标分析仪。,酶标仪,酶联免疫法,酶联免疫实验设计,实验的关键操作： 试剂盒的选择和准备； 试样的处理（同GC-MS）；加样； 洗涤； 比色。,第四节激素类兽药残留的检验,什么是激素：是生物体内特殊的腺体或组织产生的，直接分泌到体液中，通过体液运送到特定的部位，从而引起特殊激动作用的一群微量的有机化合物。 兽药：同化激素和其他生长促进剂的简称。,激素作用,促进氨基酸中蛋白质生物合成 促进肌肉变大变壮 促进食欲 促进骨骼的生长 刺激骨髓，促进红细胞的产生。,分类,按照来源：动物激素和植物激素结构：甾体（雄激素类、雌激素类、孕激素类）和非甾体类同化激素。,激素的

21、危害：扰乱激素平衡，导致内分泌相关肿瘤、生长缺陷、生育缺陷、性早熟、男性女性化、女性乳腺癌、卵巢癌等。禁止同化类激素在食品动物中使用。测试方法：荧光分光光度计、GC、HPLC、GC-MS等。,HPLC法测定禽肉中己烯雌酚残留,原理：样品匀浆，甲醇提取，HPLC紫外检测器（230nm）测定。 样品提取：肉样-甲醇振荡提取、离心（重复2次）-合并上层提取液-过滤、备用 方法说明：甲醇可以使蛋白质的氢键发生改变，蛋白质凝集，从而释放出药物。,谢 谢！,色谱法分类,气相色谱（流动相为气体） 液相色谱（流动相为液体） 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱,流动相物态,流动

22、相物态,固定相使用形式,分离过程机制,色谱法分类（按固定相状态的不同）,流动相为气体（称为载气） 固定相为固体吸附剂,气相色谱,气固色谱,气液色谱,流动相为气体（称为载气） 固定相为液体,流动相为液体（淋洗液）固定相为固体吸附剂。,液相色谱,液固色谱,液液色谱,流动相为液体（淋洗液）固定相为液体,按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱,色谱法分类,(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱 毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱,(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 离子色谱：液相色谱的

23、一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。,(3)其他色谱方法,薄层色谱和纸色谱： 比较简单的色谱方法,凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱: CO2流动相。高效毛细管电泳: 九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。,色谱法的特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。（2） 灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定

24、、生物试样的分离分析。 不足之处： 被分离组分的定性较为困难。,色谱分析理论基础,色谱分离过程是在色谱柱内完成的。 气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。 固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。 气固色谱的分离机理: 吸附与脱附的不断重复过程； 气液(液液)色谱的固定相: 由 担体和固定液所组成。 固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。 气液色谱的分离机理：气液(液液)两相间的反复多次分配过程。,1. 气相色谱分离过程,当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附; 随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附; 挥发或脱附下的组分随着载气向前

25、移动时又再次被固定相溶解或吸附; 随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。,2. 分配系数（ partion factor） K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。 在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,分配系数 K 的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K = 0时，即不被固

26、定相保留，最先流出。,3.分配比 （partion ratio）k,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,分配比可以由实验测得。,分配比也称： 容量因子(capacity factor)；容量比(capacity ratio)；,结论,1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数只决定于组分和两相性质，与两相体积无关，分配比不仅决定于组分和两相性质，且与两相体积有关，也既分配比随固定相的量而改变。 3.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。但是，对于一给定色谱体系（分配体系），组分的分离最终决定于组分在两相中相对量，而非相对浓度，因此，在实际工作中，分配比k比分配系数K更有意义。 4. 分配比可以由实验测得。,