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1、分子诊断技术在神经系统遗传病中的应用,1,01,PART ONE,两代测序技术介绍,2,DNA分子,基本单位：脱氧核苷酸含氮碱基+磷酸+脱氧核糖反向平行碱基配对原则人体大约有30亿碱基对,1953年4月自然杂志刊登了美国的沃森和英国的克里克在英国剑桥大学合作的研究成果：DNA双螺旋结构的分子模型，被誉为20世纪以来生物学方面最伟大的发现。,3,基因,基因(Gene)(遗传因子）是具有遗传效应的DNA片段（部分病毒如烟草花叶病毒、HIV的遗传物质是RNA。人体内大约有25000个基因。,“除了外伤，一切疾病的发生都与基因有关。” 诺贝尔生理学和医学奖获得者利根川进博士,4,染色体,染色体(chr
2、omosome) 是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果，是染色质的高级结构，仅在细胞分裂时才出现。染色体有种属特异性，随生物种类、细胞类型及发育阶段不同，其数量、大小和形态存在差异。,5,DNA、基因、染色体,基因是具有遗传效应的DNA片段，染色体是由DNA和蛋白质组成。,6,突变,基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定条件下，由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变，就叫做基因突变。,变异,1.大区域的删除、重复、易位、倒转（可从染色体层面解释）
3、 如：21-三体综合征,2单个基因层次的变异：碱基置换、移码、缺失和插入4种。,7,大区域的删除、重复、易位、倒转,8,突变蛋白功能改变,基因突变改变了DNA碱基序列，进而改变了转录形成mRNA的序列。mRNA在翻译时导致相关氨基酸的改变，从而影响蛋白质功能。,9,一代测序技术,一代测序又称Sanger测序双脱氧链终止法测序原理,1977年，英国人Fred Sanger发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP,就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。,10,一代测序技术,不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。,11,二代测序技术,1）Il
4、lumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像主要步骤：DNA文库制备超声打断加接头Flowcell吸附流动DNA片段桥式PCR扩增与变性放大信号测序测序碱基转化为光学信号2）Ion Torrent 原理：油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测主要步骤：DNA文库制备喷雾打断加接头乳液PCR注水入油独立PCR微电极pH检测磁珠入池记录pH,Illumina测序平台,Ion Torrent测序平台,12,两代测序技术优势比较,测得准,测不准,13,不同的疾病对应不同的测序方法,拷贝数变异（CNV）：如DMD，SMA ( MLPA )三核苷酸重复：如SCA, Huntin
5、gton, Kennedy （MLPA+片段分析）线粒体基因突变：如线粒体脑肌病 ( mtDNA检测）染色体基因点突变：如FFI、CADASIL、肝豆状核变性 ( NGS panel ),14,02,PART TWO,分子诊断技术在神经系统疾病中的应用,15,拷贝数变异（CNV）：如DMD，SMA三核苷酸重复：如SCA, Huntington, Kennedy线粒体基因突变：如线粒体脑肌病染色体基因点突变：如FFI、CADASIL、肝豆状核变性,神经系统基因病分类（不同的突变类型）,16,MLPA即多重连接依赖探针扩增法，采用多重PCR的方式进行核酸样品检测，能够在一个简单的反应内检测多达50
6、个特异核酸序列的拷贝数变化 ，因此能够检测大量基因的缺失和重复突变。,MLPA技术检测拷贝数变异,17,MLPA技术检测拷贝数变异,Eg:1. DMD 是由编码肌营养不良蛋白（dystrophin）的DMD基因突变引起。该基因是目前发现的人类最大的基因，长2.4Mb，含80个外显子，其主要突变类型为外显子缺失，占全部突变的5070，点突变约占25，重复突变约占510，突变位置无固定规律。,18,MLPA技术检测拷贝数变异,Eg:2.脊髓性肌萎缩症（SMA）常染色体隐性遗传病。SMN1和SMN2是该病的致病基因，这两个基因高度同源，仅仅存在两个核苷酸的差异，通过7号外显子和8号外显子上的两个基因
7、位点进行区分。,19,三核苷酸重复疾病,三核苷酸重复疾病是一类由于致病基因内部或调控区域三核苷酸重复序列如（CNG）n、（GCN）n、（GAA/C）n等（N示不同碱基，n示拷贝数）的异常扩增导致的一类疾病，其扩增的重复序列不稳定地传递给下一代，往往倾向于增加几个重复拷贝，拷贝数重复越多，病情越严重，发病年龄越小。,20,Eg：在SCA1疾病患者中重复单位CAG的拷贝数为39-91，而正常仅为6-44。,三核苷酸重复疾病,21,是由线粒体基因（mtRNA）或者是核基因（nDNA ）变异引起线粒体代谢酶的功能缺陷，导致ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组异质性病变。,线粒体基因突变,22,线粒体
8、基因突变,线粒体疾病谱：Cyt b，cytochrome b（细胞色素b）；FBSN，familial bilateral striatal necrosis（家族性双侧纹状体坏死）；LHON，Leber hereditary optic neuropathy（Leber遗传性）；LS，Leigh syndrome（Leigh综合征）；MELAS，mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes（线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作）；MERRF，myoclonus epilepsy with
9、ragged-red fibres（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）；MILS，maternally inherited Leigh syndrome（母系遗传Leigh综合征）；NARP，neuropathy，ataxia and retinitis pigmentosa（神经病，共济失调和视网膜色素变性综合征）; ND，NADH-dehydrogenase（NADH脱氢酶）； PEO，progressive external ophthalmoplegia（进行性眼外肌麻痹）,DiMauro S, Schon EA, Carelli V, Hirano M.The clinical maze o
10、f mitochondrial neurology.Nat Rev Neurol. 2013 Aug;9(8):429-44.,2个编码rRNA基因（16s和12s）,22个编码tRNA基因,13个编码蛋白质基因,23,染色体基因点突变,对致病基因热点突变或者全部编码区进行直接测序，与数据库参考序列进行比对即可发现突变位点。Eg: 常染色体显性遗传脑动脉病伴皮质下梗死和白脑质病（CADASIL），是由NOTCH3基因突变引起的非动脉硬 化性、非淀粉样变的遗传性脑小动脉病。,24,小结：,总体而言，NGS 技术具有 通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点, 测序（Sanger法）的读长可以达
11、到1000bp，二代测序虽然通量高，但读长从几十bp到几百bp不等，就算双端最长也不超过250bp，因此在检测大片段的缺失重复时常用到MLPA等方法。 不同的测序技术在测序范围、数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差别,如果选择适合的方法,对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。Sanger测序是目前所有基因检测方法（包括荧光定量PCR中的Taqman探针法、普通PCR法、基因芯片法、二代测序法等）的金标准。,25,03,PART THREE,纳诺基神经系统项目解读及案例分析,26,纳诺基神经系统检测项目,27,神经系统疾病循证医学科研服务,28,一、遗传性肌肉病,检测内容（451种
12、疾病，301个基因）,遗传性神经肌肉病是由于生殖细胞或受精卵遗传物质的数量、结构或功能改变，使发育的个体出现神经系统功能缺损而表现为肌张力障碍、共济失调、不自主运动、精神发育迟滞等症状的一类疾病。,29,Duchenne或Becker型肌营养不良症 (DMD),杜氏肌营养不良(DMD)属于X连锁隐性遗传病，是男性中常见的遗传性疾病。发病率约为1/3 500活男婴，女性多为致病基因携带者，发病者罕见，且症状较轻。DMD患者约30%为自发性突变，其余的为X染色体隐性遗传。在各种类型突变中，单个或多个外显子缺失突变患者占60%65%；无意义或框移造成的点突变占30%，重复占5%15%。,DMD基因定
13、位于X 染色体短臂上(Xp21.1)，基因全长约2220kb，含79 个外显子，cDNA 长14kb，是目前已知的最大人类基因。,30,DMD/BMD基因突变类型与检测路径,Aartsma-Rus A, et al., Muscle Nerve 34:135144, 2006,31,病例分享1：DMD,受检者：男，6岁。现病史：下肢无力，较去年行走主动性下降，不如去年灵活，走路踮脚较去年明显。运动功能：15个月独立行走，3-5岁独立行走，爬楼梯正常，下蹲起需扶膝，跑不快，跳正常。专科检查 精神状态：查体合作，左利手，高颚弓畸形，颞肌正常，双侧腓肠肌肥大，舌体正常，扁桃体正常，步态正常，表 现G
14、owers征，膝腱反射正常，指鼻稳准，轮替实验：可，无足下垂，脊柱有侧弯，无关节挛缩。肌力：上肢近端左 5、右 5，上肢远端左 5、右 5；下肢近端左 5、右 5，下肢远端左 5、右 5。心电图：心率70次/分，窦性心率不齐。心脏彩超：EF：61%，LVEDD：33mm，结果：三尖瓣少量回流。其他检查：CK值异常升高。初步诊断：DMD,32,病例分享1：DMD检测结果,图2-1 受检者DMD基因427m c.C8713T变异的一代测序验证,图2-2 受检者母亲DMD基因427m c.C8713T变异的一代测序验证,33,二、遗传性运动神经元病,遗传性运动神经元病（MND）是一组病因未明的选择性
15、侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮层锥体细胞及锥体束的慢性进行性神经变性疾病。,ALS,SMA,KD,肌萎缩侧索硬化症,脊髓延髓肌萎缩症,脊肌萎缩症,34,检测内容（73种疾病，67个基因）,63种疾病57个基因,10种疾病10个基因,运动神经元病,鉴别诊断相关,35,2.1. 肌萎缩侧索硬化症,肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）俗称“渐冻人症”，是一种累及人体上、下运动神经元的慢性进行性变性病，属于运动神经元病的一种。 临床表现为自肢体远端开始的非对称性肌无力和肌萎缩，患者会出现吞咽困难、呼吸功能障碍等症状；由于只累及到患者的运动神经元，
16、因而患者的思维和智力都不受影响。我国ALS患者约有6万多名，通常中年起病（平均年龄46岁，散发性为60岁），起病隐匿，呈慢性进展性病程。在美国，ALS早期误诊率达43%。,36,2.1. ALS相关分类,37,2.2. 脊肌萎缩症（SMA）,脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是由于脊髓前角细胞变性为主要病理改变，以近端肌肉对称性、进行性萎缩和无力为主要表现，是儿童最为常见和严重的常染色体隐性遗传病（AR），发病率约为1/100001/8000 ，人群中的携带率为1/35-1/50。,38,SMN1基因被称为“运动神经元生存1号”基因，位于5q13，负责编码“运
17、动神经元生存”（SMN)蛋白。SMA患者的SMN1基因由于缺失或突变，导致SMN蛋白缺乏，对运动神经元产生严重影响。缺乏SMN蛋白时，神经细胞将萎缩并最终死亡，从而导致SMA患者身体躯干和四肢近端骨骼肌发生渐进性、对称性肌无力和肌萎缩。 95%以上的SMA患者为SMN1的7号和（或）8号外显子缺失导致，用MLPA检测SMN1基因的拷贝数是SMA携带者筛查和临床确诊的重要手段。 检测可明确生育SMA患儿的遗传风险，或通过产前诊断降低人群中SMA患儿的出生率。,22.2. SMA与SMN1基因,39,2.3. 脊髓延髓肌萎缩症（KD）,脊髓延髓肌萎缩症（SBMA/SMAX1）又称Kennedy病（
18、KD）是一种晚发的X连锁隐性遗传病（XR），主要累及下运动和感觉神经元以及内分泌系统，表现为进行性四肢和延髓肌无力、肌束震颤和肌肉萎缩。患者一般于15-60岁发病，平均发病年龄为27岁。,Kennedy病是由于雄激素受体（AR）基因1号外显子中编码多聚谷氨酰胺的CAG区域出现重复序列异常拓展所致。CAG重复序列在健康人中的次数为10-36次，而患者大于40次。,直接鉴定AR基因上（CAG）n重复序列拷贝数已成为确诊本病的可靠指标。,40,三、遗传性周围神经病,遗传性周围神经病是一组周围、运动、感觉自主神经元的功能障碍和结构改变所致的疾病，发病率约为1/2500。,HMSN（CMT）,HSNHS
19、AN,dHMN,遗传性运动感觉神经病（腓骨肌萎缩症）,远端型遗传性运动神经病,遗传性感觉神经病遗传性感觉自主神经病,41,遗传性周围神经病检测内容,128种疾病，107个基因,42,3.1. 遗传性运动感觉神经病 (CMT),遗传性运动感觉神经病（HMSN）又称为腓骨肌萎缩症（CMT），是一组遗传异质性非常高的周围神经系统的神经遗传病，其临床特点为四肢远端肌肉进行性肌无力和萎缩伴感觉障碍，腱反射减弱或消失，可呈典型的弓型足、脊柱侧弯以及“鹤腿样”畸形，通常在20岁以前发病。患病率为30-40/10万。其遗传方式绝大多数为常染色体显性遗传（AD），也可呈常染色体隐性（AR）和X连锁遗传（XR）。
20、新发突变似乎比较常见，多达1/3的患者属于此类突变。,43,3.1. CMT相关分类,44,3.2. 遗传性压力易感性周围神经病（HNPP）,遗传性压力易感性周围神经病(HNPP)又称压迫敏感性周围神经病（腊肠体样周围神经病、家族性复发性多神经病），主要临床特征是在轻微的机械损害和压迫的情况后反复出现肢体麻木、无力，弥漫性的神经传导速度(NCV)减慢。常染色体显性遗传，部分患者为散发。发病年龄差异较大，可7-62岁，但大多在10-30岁起病，男女无差异。本病为自限性疾病，无须特殊治疗。病理特征：髓鞘增厚形成腊肠体样结构和节段性脱髓鞘。与HNPP相关的基因PMP22基因,PMP22基因定位于17
21、号染色体短臂1区2带（17p12），编码外周髓磷脂的蛋白。该蛋白与生长调控及外周神经系统髓鞘形成有关,45,3.3. 远端遗传性运动神经病(HMN),远端遗传性运动神经病（HMN）是一组由于脊髓前角运动神经元退行性变引起的以远端为主的遗传性周围运动神经病，占所有遗传性神经病的10%，绝大部分为常染色体显性遗传（AD）。有时伴有锥体束征、声带麻痹或偏好从手开始发病。,46,四、遗传性心脑血管病(CVD),检测内容：20大类疾病，344种疾病，319个单基因,47,4.1. 常染色体显性遗传合并皮质下梗死和白质脑病(CADASIL),CADASIL是常染色体显性遗传合并皮质下梗死和白质脑病，是一种
22、由NOTCH3基因突变引起的非动脉硬化性、非淀粉样变的遗传性心脑小动脉病。该病的遗传方式为常染色体显性遗传（AD）。大多数在中年早期起病，通常发生在40-50岁，平均年龄为46岁。一般患者从发病到死亡为3-43年，平均23年。最常见的临床表现是偏头痛和短暂性心脑缺血发作或缺血性心脑卒中（85%），可伴有情感障碍。随着病情的发展可出现皮质下痴呆、假性球麻痹和尿失禁等。基本病理表现是血管平滑肌细胞的退变，病变主要见于心脑室周围、外囊、基底核、丘心脑和心脑干等处。,48,4.1. CADASIL相关病例分享：,受检者：男，41岁，国企职工。现病史：起病急。患者于1月前饮酒后出现言语不流利，渐进性加重
23、。无发热、头痛、头晕、饮水呛咳、肢体活动及感觉障碍、抽搐等伴发。起病以来，患者精神、食欲可，大、小便正常。既往史：否认高血压、糖尿病、心脏病、脑卒中病史。否认肝炎、结核病史及其接触史。否认手术、输血史。否认特殊食物、药物过敏史。家族史：父亲、祖父有脑梗病史；家族成员无特殊遗传以及传染病史记载。婚育史：26岁结婚，育有一女。专科检查 精神状态：意识清晰，情感正常，定向力、记忆力正常，理解判断好，自知力存在。言语情况：不完全运动性失语，无构音障碍。头颅MRI：右侧半卵圆中心亚急性脑梗死：双侧脑室旁、双侧基底节区、胼胝体多发陈旧性脑梗死。超声提示：双侧颈部血管未见异常；心内结构及血流未见明显异常。T
24、CD提示：脑血管超声未见明显异常。影像学诊断：1）右侧半卵圆中心区异常信号，考虑亚急性期脑梗死；2）脑内多发软化灶（双侧半卵圆中心区、侧脑室旁白质、基底节区、胼胝体体部）；3）双侧大脑半球皮层下白质内多发异常信号，考虑缺血性改变；4）双侧额叶及侧脑室旁白质内对称性异常信号，考虑缺血性改变可能性大。心脏检查发现：窦性心律不齐，偶发室性早搏，房性早搏，ST段全天未见明显偏移。其他检查：患者血常规、凝血功能、甲状腺功能、免疫学检查等均有异常指标。初步诊断：1.急性脑梗死（右侧半卵圆中心）；2.多发陈旧性脑梗死,49,4.1. CADASIL相关病例分享检测结果,受检者TTN基因c.G13388A杂合
25、变异一代测序验证,50,4.2. Marfan 综合征(MFS),马凡综合征是常染色体显性遗传病。病人典型表现是骨骼系统四肢细长，包括手指和脚趾细长，伴有韧带的松弛、关节的脱位、脊柱侧弯畸形、眼部病变。马凡综合征最危险的合并症是可以造成主动脉瘤、主动脉夹层、心脏瓣膜病变（主动脉瓣和二尖瓣关闭不全）。,基因位于15号染色体长臂2区1带1亚带（15q21.1）。目前已登记的可引发Marfan 综合征的突变有1847种类型，实际类型应该更多，因为很多突变类型都没有登记。其突变谱为：65%为点突变，10%-15%为小删除、插入或重复，10%-15%为剪接突变，25%的突变是新发突变。,MFS相关基因：
26、FBN1,51,五、共济失调和痉挛性截瘫（HSP）,94种疾病93个基因,104种疾病105个基因,遗传性共济失调,遗传性痉挛性截瘫,包含：188种疾病，179个基因，片段分析检测10种SCA亚型。,52,5.1.遗传性共济失调(HA),5.1.1.进行性共济失调,53,5.1.2. 发作性共济失调,EA：发作性共济失调,54,5.1.3. 常染色体隐性遗传性共济失调,55,5.2. 遗传性痉挛性截瘫,遗传性痉挛性截瘫（HSP）是一组具有明显临床及遗传异质性的神经系统遗传病,临床上以进行性双下肢肌张力增高和肌无力为主要特征。其发病率为0.9%-9.6%。,56,六、遗传性脑白质病,遗传性脑白质
27、病，又称脑白质营养不良，是一组由遗传因素所致的主要累及中枢神经系统正常髓鞘生长受累的疾病，其基本特点为中枢白质的髓鞘发育异常或弥漫性损害。,检测内容（113种疾病，119个基因）,57,6.1. X连锁肾上腺脑白质病(ALD),X连锁肾上腺脑白质病（X-ALD）是由于ABCD1基因突变导致ALDP蛋白功能丧失，引起极长链脂肪酸（VLCFA）在线粒体内脂肪酸氧化障碍，在神经组织及肾上腺细胞中沉积。其特点是脱髓鞘和神经退行性疾病，导致神经功能丧失和死亡。,ABCD1基因定位于X染色体长臂2区8带（Xq28）编码肾上腺脑白质营养不良蛋白（ALDP）。,58,6.2. Pelizaeus-Merzba
28、cher病(PMD),Pelizaeus-Merzbacher病（PMD）是一组由于蛋白脂蛋白1（PLP1）相关的髓鞘形成不足所致的疾病。,大约8095男性患者有可确认的PLP1基因异常，包括基因重复（Duplication）、点突变和基因缺失（Deletion）。,PLP1基因定位于X染色体长臂2区2带2亚带（Xq22.2），编码跨膜蛋白脂蛋白1（PLP1）。PLP1是中枢神经系统髓鞘的主要成分，约占整个髓鞘蛋白的50%，该蛋白在髓鞘的形成或维持以及在少突胶质细胞发育和轴突的存活中可能起着重要作用。,59,6.3. Canavan病(CD),Canavan病（CD）又称为海绵状脑白质营养不良
29、(SLD)，是由于N-乙酰天冬氨酸转移酶缺乏，导致萘乙酸（NAA）在患者尿液、血液及脑内聚积，为常染色体隐性遗传。临床主要表现为颈部肌群肌张力缺失或减退、下肢强直呈过伸位、上肢屈曲位、失明、严重的精神缺陷、巨颅畸形。按照临床表现分为先天型、婴儿型、少年型。平均死亡年龄为18个月。,ASPA基因定位于17号染色体短臂1区3带3亚带（17p13.3），编码天冬氨酸氨基转移酶。天冬氨酸氨基转移酶将N-乙酰天冬氨酸分解为天冬氨酸和乙酸，研究认为N-乙酰天冬氨酸主要分布在脑白质中，其水解对于维持脑白质的功能十分重要。,60,04,PART FOUR,经典报告病例分享,61,线粒体病例分享,患者信息：薛*
30、，男，17岁临床表现：发作性肢体抽搞伴意识丧失4次 患者于2018.4.14日凌晨2时患者在无明显诱因下突发四肢抽搐及牙关紧闭、双目上视、呼之不应，当时患者未做特殊处理，约1分钟后患者自行苏醒，患者未做特殊处理，后又连续发作两次，症状大致同前，约4-5分钟后自行苏醒，第三次患者醒后出现头痛，伴恶心、呕吐症状，为求诊治，惠者于当日前往邓州市人民医院住院治疗(具体不详)，患者于4月22日 再发抽搐，约4-5分钟后苏醒，后一直口服卡马西平 (1片 每天三次) 控制症状，今日患者为进步诊断及治疗来我院， 门诊以“抽搐查因”收入我科。发病以来精神睡眠欠佳，大小便正常，食欲可。既往史:患者于邓州市*医院住
31、院期间发现慢性肾病、肾性贫血及高血压，现予以硝苯地平缓释片控制血压，血压控制可。患者既往有智力发有相对低下病史，无手术史，无食物及药物过敏史。,62,线粒体病例分享,体格检查: T 36.8、BP148/100mHg、P93次/分、R18次/分 神清，精神尚可，定向力、 理解力大致正常，计算力差，双侧瞳孔等大等圆， 光反射灵敏， 双侧眼球活动灵话，心肺腹未见明显异常， 颈强3指，克氏征阳性，共济失调阴性，四肢肌力肌张力正常，病理征，深浅感觉正常。辅助检查:2018.04.16日邓州市*医院血常规正常，2018.5. 25日血常规示:红细胞2.68*10-12/L血红蛋白83g/l，2018.0
32、4.15日肾功能提示：肌酐136umol/L2018.05.55日肾功能提示：肌酐120umol/L2018.04.17日脑脊液常规示：无色，清透，白细胞20*10-6/L，红细胞30*10-6/L，生化示:葡萄糖2.76mmol/L，氯125mmol/L，脑脊液总蛋白472mg/l；2018.05.06日脑脊液常规示：无色，清透，白细胞10*10-6/L，红细胞20*10-6/L，李凡它试验阴性。脑脊液生化示:葡萄糖2.37mmol/L，氯128mmol/L，脑脊液总蛋白743mg/l；肝胆胰脾肾彩超示：双肾弥漫性病变声像，请结合临床。2018.05.13日磁共振示：NAA峰值下降并高达La
33、c峰，提示代谢性病变（如线粒体脑肌病可能），建议结合临床进一步确诊。2018.05.22日郑州金域临床检验中心线粒体病相关基因测序未见异常。,63,线粒体病例分享,诊断分析：定位：右侧大脑半球定性：代谢性？感染性？诊断：一、抽搐待查，线粒体脑病？ 二、慢性肾病，既往病史明确。鉴别诊断：原发性癫痫,64,线粒体基因突变,DiMauro S, Schon EA, Carelli V, Hirano M.The clinical maze of mitochondrial neurology.Nat Rev Neurol. 2013 Aug;9(8):429-44.,2个编码rRNA基因（16s和1
34、2s）,22个编码tRNA基因,13个编码蛋白质基因,65,线粒体疾病分类,线粒体DNA突变引起的疾病 （如常见的LS、MELAS等）缺陷基因位于核基因组的疾病 （如ANT1基因突变可导致细胞中的mtDNA数目的减少，临床症状有肌无力，共济失调，听力下降和周围型神经炎等。）核基因组与mtDNA间信息交流缺陷而造成的疾病mtDNA获得性突变,66,实验室检查,线粒体病基因检测组合1,1. 线粒体DNA全长测序及MLPA检测,2. 线粒体核基因测序,送检项目：,实验结果：,线粒体DNA测序结果：受检者线粒体DNA上MT-ND1基因存在m.3946GA（p.Glu214Lys），变异比例为33%，为
35、致病性变异。2. 线粒体核基因测序结果：线粒体核基因测序结果未见明确致病性变异。3. 线粒体DNA相关基因MLPA检测结果：应用MLPA技术对线粒体DNA相关基因进行检测，未发现任何大片段缺失或重复突变；未检测到线粒体DNA存在m.11778GA、m.14484TC、m.8344AG、m.3460GA及m.3243AG的突变。,67,结果说明,线粒体DNA测序结果显示：受检者线粒体DNA上MT-ND1基因存在m.3946GA（p.Glu214Lys），变异比例为33%。该变异为错义突变（预计会使所编码蛋白质的第214位氨基酸由Glu变为Lys）。该变异位于线粒体DNA的MT-ND1基因，有文献
36、报道，该变异与线粒体脑肌病（MELAS）相关。同时，m.3946G位点在进化上高度保守，发生G3946A突变之后会引起酶复合体I（Complex I）的缺乏并影响蛋白结构的稳定性。,1 Hum Mol Genet. 2006 Sep 1;15（17）: 2543-52. Epub 2006 Jul 18.PMID: 16849371/Eur J Hum Genet. 2011 Jul; 19（7）: 769-75. PMID: 21364701.,68,帕金森病例分享,患者：宋*，女，16岁临床表现：手抖3年送检项目：帕金森及肌张力障碍,69,实验结果,受检者PRKN基因（转录本NM_0045
37、62)外显子7存在c.C823T的纯合型核苷酸变异（编码区第823号核苷酸由C变成T)，该变异导致编译第275 号氨基酸R的密码子变成W (p.R275W)，为错义变异。,图1受检者PRKN基因c.C823T杂合变异代测序验证,表1受检者PRKN基因变异信息,70,家系验证,PRKN 基因（转录本NM_004562）外显子7 c.C823T 变异位点验证：王利PRKN 基因（转录本NM_004562）外显子7 存在c.C823T 的杂合型核苷酸变异位点；宋萍PRKN 基因（转录本NM_004562）外显子7 未检测到c.C823T 的变异位点,图1A 宋洁PRKN 基因c.C823T 纯合变异
38、一代测序验证,图1B 王利PRKN 基因c.C823T 纯合变异一代测序验证,图1C 宋萍PRKN 基因c.C823T 纯合变异一代测序验证,71,结果说明,受检者PRKN基因（转录本NM_004562）外显子7存在c.C823T的纯合型核苷酸变异（编码区第823号核苷酸由C变成T），该变异导致编译第275号氨基酸R的密码子变成W（p.R275W）。已在多名帕金森患者中检出该变异位点1-2。该变异及其罕见，在ExAC数据库中的频率为0%，在千人基因组数据库中无频率记录。按照ACMG指导原则，确认该变异位点的等级为可能致病性变异。需要说明的是，由PRKN基因变异引起的遗传性帕金森综合征2型，为常
39、染色体隐性遗传（AR），受检者样本中PRKN基因c.C823T变异为纯合型核苷酸变异，符合由PRKN基因变异引起的遗传性帕金森综合征2型的遗传模式。,1 Marote A, Pomeshchik Y, Goldwurm S, et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line (CSC-44) from a Parkinsons disease patient carrying a compound heterozygous mutation (c.823CT and EX6 del) in the PARK2 gene. St
40、em Cell Res.2018 Mar;27:90-94. Epub 2018 Jan 4. PubMed PMID: 29353703.2 Bognar C, Baldovic M, Benetin J, et al. Analysis of Leucine-rich repeat kinase 2(LRRK2) and Parkinson protein 2 (parkin, PARK2) genes mutations in Slovak Parkinson disease patients. Gen Physiol Biophys. 2013 Mar;32(1):55-66. Pub
41、Med PMID:23531835.,72,结果说明,遗传性帕金森综合征2型（Parkinson disease 2）是一种进行性神经系统疾病，又称常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征，一般发病年龄小于40岁。这种疾病会影响大脑的几个区域，尤其是控制平衡和运动的黑质区域。遗传性帕金森综合征2型的第一个症状通常是肢体的发抖或者震颤，尤其是身体处于静止状态时。典型的表现是，震颤始于躯体的一侧（尤其是手）。震颤还可以影响胳膊、腿脚和脸。帕金森病的其他特征包括肢体和躯干的僵直，运动迟缓或无法运动，以及平衡和协调能力受损，该疾病也会影响人的情感和认知功能。一些患者发展成为精神疾病，如抑郁或者幻觉等。患
42、帕金森的病人出现痴呆症的风险也会增加。一般情况下，发生在50岁以后的称为迟发性帕金森；50岁之前出现症状的称为早发性帕金森；在20岁前开始发病的被称为青少年型帕金森。帕金森在美国的发病率为13/100,000。,73,癫痫病例分享,患者：吴*，女，17岁检测结果：受检者FLNA基因（转录本NM_001456）外显子17发现c.2555_2556delAA的杂合型核苷酸变异（编码区第2555号和第2556核苷酸AA被删除），该变异导致编译的蛋白分子从第852号氨基酸F处开始移码，并在移码后第2个氨基酸处产生提前终止密码子（p.F852fs*2X）。该变异位点可能与脑室旁灰质结节异位症（Periv
43、entricular heterotopia）相关。,注：NA表示数据库未有相关记录；DM?表示预测结果为可能致病性变异。,受检者FLNA基因c.2555_2556delAA杂合变异一代测序验证,74,结果说明,结果说明： 目前尚无该变异引起脑室旁灰质结节异位症的任何相关文献报道。移码及提前终止变异一般都会影响基因所编码的蛋白分子的功能，可造成截短型、功能受损的蛋白分子，或因为mRNA内部存在异常的提前终止密码子而触发对mRNA的降解，从而导致蛋白分子的表达沉默。此外，ClinVar数据库中位于p.F852fs*2X之后的所有无义突变均注释为明确致病性及可能致病性变异，由此可以推测p.F852fs*2X可能为强烈的功能缺失型变异。该变异极其罕见，在ExAC数据库和千人基因组数据库中均无频率记录。按照ACMG指导原则，该变异点的等级确认为可能致病性变异。,75,76,
