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1、湿热灭菌原理和常用灭菌设备介绍,内容,范围湿热灭菌基础灭菌法选择的基本原则灭菌方法的开发及选定记录仪表几种常用的湿热灭菌设备介绍,范围,蒸汽-湿热灭菌具备无残留，不污染环境，不破坏产品表面，易于控制和重现性好等优点，被广泛应用于注射剂的除菌过程之中。GMP的产生和发展（包括理论和实践）都与药物制剂的灭菌过程有关。对无菌产品的制造厂而言，没有什么比灭菌更为重要,为什么我们的产品需要无菌？,我们讲无菌，涵意是什么?,在生产过程中要做到没有活的微生物是不可能的，因为有：人员；原辅料 / 包装材料；接触产品设备的表面；用于清洗/淋洗的液体；环境,物料,人员,设备的表面,清洗液,接种的纸质载体,在革兰氏
2、阴性菌的细胞壁中脂多糖这是细菌内毒素也叫热原,细菌内毒素,革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,106105104103102101100,灭菌剂量 (时间),对数表示1 x 103 = 10001 x 101 = 10,微生物数,杀灭微生物,无菌保证水平达到 10-6,10610510410310210110010-110-210-310-410-510-6,微生物数以恒定的速率下降 (D value),我们想提高灭菌的“概率”提高无菌信心的安全限度无菌保证的水平要优于百万分之一!,杀灭微生物,灭菌剂量 (时间),继续灭菌以提高无菌保证的水平,10610510410310210110010-110-2
3、10-310-410-510-6,我们可以检验微生物数的下降情况,杀灭微生物,微生物数以恒定的速率下降 (D value),继续灭菌以提高无菌保证的水平,灭菌剂量 (时间),我们可计算可信度增加的程度/无菌保证水平,无菌保证水平达到 10-6,原料的质量检验,对接触产品表面消毒并控制生物负荷,灌封操作。最终密封容器,内包材料清洗、消毒去热原,全过程强化环境控制,热原控制一直到最后一步,在密封的容器中最终灭菌,SIP,设备消毒,隧道灭菌器,最终灭菌,过程控制示意,湿热灭菌基础,空气蒸汽水细菌内毒素过度杀灭残存概率其他,过热,潜热,显热,100oC,0oC,热 (能量),温度,蒸汽,压力的测试,表
4、压,绝对压力,最高真空,大气压（约1巴绝压值，表压为0）,最佳真空（0 巴绝压值）,绝压值=表压值+1个大气压,通常的压差值,bar a = 绝压值g = gage的缩写，bar g=表压值，绝压值与表压值相差1个大气压,压力沸点表,表压,绝压值,沸点,表压,绝压值,沸点,对灭菌柜及SIP而言Dryness/干度 潜热的量Superheat/过热 超过的温度 NCG/不凝气体 不凝气体的 %Condensate Quality 冷凝水质量GB 18278-2000 医疗保健产品灭菌确认和常规控制要求工业湿热灭菌.pdf A5.2.2.1HTM2010HTM2010-31.pdf 9.0湿热灭菌
5、工艺验证指南-08-12-08.doc 附录对密封容器中的液体而言冷凝水质量 (根据风险分析确定),蒸汽的质量,灭菌工艺 (灭菌柜的SIP),不凝气体测试点,干度和过热测试点,蒸汽温度参考点,不凝性气体,造成不凝性气体的原因：蒸汽发生器的供水温度低(建议 80)在蒸汽分配系统中滞留空气 (不良的系统设计，疏水器出故障)蒸汽启动程序不当 (没有将分配管路中的空气吹除掉),蒸汽干度,蒸汽干度是蒸汽中潜热的量度最理想是100%潜热，有最大的能量来加热装载限度标准一般多孔性装载：0.90 (90%)金属装载：0.95 (95%),蒸汽干度,干度为 0.9 = 90% 的潜热干度为 1.0 = 100%
6、 的潜热,蒸汽的特性,冷凝水的管理,冷凝水是以下任何一个地方都需要加以管理的问题蒸汽发生器蒸汽分配系统灭菌柜管路灭菌柜腔室冷凝水始终不断地产生,冷凝水的管理,蒸汽流动的方向应有斜坡,冷凝水跟着蒸汽流动,冷凝水的管理,冷凝水比蒸汽重，它会向下流动,湿热灭菌基础,湿热灭菌的机理细胞繁殖的最终停止蛋白质变性湿热灭菌工艺验证指南-08-12-08.docPDA_TR-1-Technical_Report_No.1.pdf,湿热灭菌基础,影响芽孢耐热性的因素物理/化学条件湿度能量转移传导对流辐射,湿热灭菌基础微生物杀灭的数学模式,实验表明，在恒定的灭菌条件下，微生物（只指芽孢）的死亡遵循一级动力学规则。
7、 芽孢的杀灭率（体现为残存曲线）是耐热性的函数，与芽孢的数量无关。 采用内生芽孢（生物指示剂BI）的悬浮液或放在载体形式的芽孢进行灭菌试验的结果表明，在湿热灭菌中，半对数规则适用于芽孢的灭活过程。,湿热灭菌基础微生物杀灭的数学模式,残存曲线可用如下的一级方程式来描述： Log NF = Log No -F(T,z)/DT,湿热灭菌基础微生物杀灭的数学模式,湿热灭菌基础微生物杀灭的数学模式,残存曲线的半对数模式必须满足二个先决条件：挑战菌应是均一的（没有其它杂类芽孢）挑战菌的灭菌条件相同，或能折算成相同的灭菌条件，例如，折算标准灭菌时间,D VALUED值,在基础温度下减少一个Log菌数所需的时
8、间。就是在一定温度下，将微生物杀灭90（即下降一个对数单位）所需的时间。,6,5,4,3,2,1,0,-1,-2,-3,-4,-5,-6,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,Log # ofSurvivors残存物Log数,Minutes at 121.1 oC 在121.1 oC 时的分钟,D value = 1D值 = 1,Thermal death curve热杀死曲线,D VALUED值,微生物名称 温度介质 D值（分）嗜热芽胞杆菌1055葡萄糖 87.8嗜热芽胞杆菌1105葡萄糖 32.0嗜热芽胞杆菌1155葡萄糖 11.7嗜热芽胞杆菌1215葡萄糖 2.4嗜热芽胞杆菌 121
9、5葡萄糖乳酸液2.1嗜热芽胞杆菌121注射用水 3.0嗜热芽胞杆菌1055葡萄糖 1.3嗜热芽胞杆菌105注射用水 13.7嗜热芽胞杆菌115注射用水 2.1,D 值的测试,低热力程序 或单独测试D值欧洲药典要求“确认BIs在121 (+/- 1) 灭菌仍有存活孢子”用至少106 及D为1.5计算存活时间，得到：存活时间 (Log No -2) D 值存活时间 4 x 1.5分 = 6 分钟,对微生物数的说明,BI 的每单元的最低数量USP 104EP 5 105ISO 11138 1 105通常 106 以获得6个对数下降单位的证据,D 值标准,D 值及第一单元 (BI) 的数量USP 10
10、4D121 = 1.5 至 3分钟EP 5 105 D121 1.5 ISO 11138 1 105 D121 1.5 通常数量 1 106 D121 1.5 分钟,10610510410310210110010-110-210-310-410-510-6,无菌保证水平达到10-6,灭菌时间,可测试部分,计算部分,无菌保证水平,活微生物以恒定速度/D下降数,继续灭菌以提高无菌保证水平,Z VALUEZ值,Z值是指使某一种微生物的D值下降一个对数单位时，灭菌温度应升高的度数。,Z值对于比较不同灭菌过程温度的标准灭菌时间F0值计算是必须的,10,121.1,111.1,131.1,1,0.1,Lo
11、g ofD ValueD值的Log数,Z Value = 10 oCZ 值 = 10 oC,Temperature oC 温度,Z VALUEZ值,嗜热芽胞杆菌在不同溶液中的Z值溶液 Z值（）5葡萄糖水溶液 10.3注射用水 8.45葡萄糖乳酸液 11.3PH7磷酸盐缓冲液 7.6平均 9.4,灭菌方法的开发和选定,过度杀灭法。假设：N0106D1211分钟Z10将数据代入公式，得L=1，再按计算，达到微生物残存概率为一百万分之一所需的物理及生物杀灭力如下：物理杀灭力FPHY为12分钟，生物杀灭力 FBIO D121（LogN0Log NF）12分钟,灭菌方法的开发和选定,残存概率法假设产品的
12、生物负荷测试中：N0102D1211分钟Z10经灭菌后，微生物残存概率NF小于10-6利用上面的数值，可以计算出微生物残存概率小于10-6所需的FPHY和FBIO如下：F0FPHYFBIOD121（LogN0Log NF）8分钟,灭菌方法的开发和选定,装载类型的界定考虑到装载的特性及特定装载的方式。例如，多孔/固体物品通常包括但不局限于以下物品：过滤器（薄膜式过滤器、筒式过滤器、预过滤器等）胶塞和其它聚合物密封件管道和软管工作服、口罩清洁用具设备更换部件，如药液灌装液体装载通常包括但不局限于以下物品：已灌装入最终容器（如小瓶、软包装、玻瓶或安瓿）的产品（溶液、混悬剂或乳剂）已检验或加工后剩下的
13、可能含有致病菌的废液。灭菌-方法-设备-确认-练习.doc,灭菌策略,决策树湿热灭菌工艺验证指南-08-12-08.docPDA_TR-1-Technical_Report_No.1.pdf如何制定灭菌策略？湿热灭菌选择与策略.ppt,湿 热 灭菌,10%,1%,0.1%,0.01%,灭菌柜总会有泄漏,压力,0.001%,门密封,垫圈,阀门,欧洲的泄漏率测试标准BD测试和泄漏测试-HTM2010-11.doc保持10分钟： 13mB 真空低于 70mB(a)温度稳定 注：1.3 mB 由 1mm Hg (原始标准)换算而得,灭菌柜总会有泄漏,生产前 工程设计及试车开发灭菌程序/周期验证常规生产
14、时排放点温度腔室压力记录时间,根据装载所有部分的热力学及生物学数据,不能直接知道在装载内部正发生什么情况,性能的监控,液体灭菌,最终灭菌的目标,无菌保证水平优于百万分之一将每个接触面加热并使其及药液升至121，保持20分钟产品不能损坏.,蒸汽引入,T,P,温度 .,液体装载的灭菌,你的待灭菌装载,要考虑哪些问题?蒸汽能否穿透?高密度包装的装载滞留冷凝水?这是否影响灭菌?塑料 / 软包装容器是否因灭菌损坏?如何对灭菌周期监控?怎么知道蒸汽已穿透到所有部位？,蒸汽能穿透吗?,验证将能证明，蒸汽能够穿透到所有装载因此，装载必须和经验证的方式相同会出什么问题呢?,冷凝水滞留,引入蒸汽后，它不只是充满腔
15、室以及装载之间，它必须将所有地方升温，包括产品灭菌车腔室肯定会生成冷凝水!必须控制冷凝水!,冷凝水滞留,在开始的低温度下，就会产生冷凝水了如果让冷凝水积聚，它就成为积聚装载的绝热体.在此情况下，是看不出来的.这部分装载将达不到你所预期的灭菌效果.因此 通过验证并要采用重现性好的装载方式!,如何监控灭菌周期?,在验证中，我们已经用温度及生物学数据证明，持续一致地加热并灭菌所有装载.在生产过程中，我们没有这些数据.因此，我们尽可能重复并保持设备及经验证的状态，这是至关重要的.还有什么能给我们增强信心?,如何监控灭菌周期?,腔室温度整个腔室的温度给出了蒸汽分配均匀的信息，但不是蒸汽穿透到所有装载的信
16、息。装载温度你产品的温度探头进一步给出了蒸汽分布的证据，且产品正缓慢地达到加热点,温度的监控,温度监测十分重要它是蒸汽分布情况的有效证据要有正确的控制温度要控制好蒸汽的进汽阀门由于温度监测的至关重要性有必要定期校准还要有第二个测试 (曲线记录图),可靠的装置有利运行(更长时间)可安装在层之间插入的长度可调节，以适用不同的瓶子测试区域在几何中心或升温缓慢的位置,探头安装示例,温度探头测试点应在升温慢的位置通过比较大的瓶子进行试验确定升温缓慢点的位置类似的瓶子取其几何中心插入长度不能根据视线来定,探头插入的深度,插入的探头对装载有影响?探头是否确实在最冷点位置?探头本身是否也会影响结果?,我们是否
17、能够信赖装载探头的温度?,温度监测点,腔室温度 (空载) 装载产品的温度寻找一致性与经验证的相同设备性能具备重现性,灭菌曲线,产品温度,时间,121oC,这是灭菌周期的杀灭力/效果,70oC,哪些因素会影响杀灭效果？,蒸汽的压力/能力一次同时运行数个灭菌柜所遵循的规则?低蒸汽压有报警吗?产品的起始温度直接取自冰箱吗?冷却的有效性冷却水的能力？冷却水的温度?,121oC,121oCFor 20 分钟,升温快！灭菌率却小！,产品温度,时间,121oC,121oCFor 20 分钟,冷却快！灭菌率也小！,产品温度,时间,温度监测,不能只依赖控制系统整个周期的杀灭力是十分重要的加热保温/稳定性冷却异常
18、的灭菌周期应当做标记（作为案例）并加以讨论,平衡的压力灭菌程序,密封容器中液体的灭菌,在常温常压下，灌封液体并有顶空的密封容器在加热时会怎样?内压升高,在20及大气压下，灌装80%的瓶子,灭菌温度121oC,在容器中的绝对压力为4 Bar (a),121oC下的蒸汽压,压差为2 巴,密封容器中的压力,平衡的压力灭菌程序,我们有必要降低此压差2 Bar 的压差将会:-损坏包装损坏密封必须加热到121oC，可靠地达到灭菌要求必须升高腔室的压力，以降低压差,灭菌周期中标准灭菌时间及Fo在液体装载灭菌中的应用,液体产品在灭菌温度下保持15分钟,灭菌曲线,灭菌周期的杀灭力,加热及冷却阶段，对总的标准灭菌
19、时间也有不少贡献改善灭菌周期的效率受产品限止,译注： Overall Cycle Lethality，以Fo表述，即总标准灭菌时间 文献中将Fo称作物理杀灭力。,灭菌周期的总标准灭菌时间,如果我们决定采用加热方法灭菌，我们就要尽可能让灭菌有效。我们有必要理解整个灭菌周期的杀灭力，不能只看保温阶段的效果需要应用Fo的概念来理解并确认总的标准灭菌时间（杀灭力）,Fo的概念,Fo 等同于121的灭菌时间因此，一个Fo达到20分的灭菌周期，就是在121灭菌20分钟的程序。20 Fo = 121 下20分钟,Fo的概念,Fo = 10(Ta Tr /z)式中：Ta = 实际温度 Tr = 参照温度 (1
20、21oC)z = 微生物的温度系统 (z = 10oC),Fo的概念,可将每一个温度样计算Fo，然后累计得到整个程序的Fo，即: 灭菌程序的累计Fo值每个热电偶或温度探头，均可计算，得到整个程序累计的Fo值,Fo设定25，在灭菌程序结束时，每个位置Fo至少达到40,25 Fo,40 Fo,Fo图,黑线及上图二个程序是等价的,40Fo,Fo图,这个程序每个点Fo至少为20 Fo，但在121却只保持了一分钟,冷却最慢,冷却最快,升温最慢,升温最慢,Fo图,Fo的应用,用于热稳定性差的产品改善程序的功能/灭菌的结果不适用于多孔的装载!,灭菌器的程序控制和记录仪表,原则要求对于每次加热灭菌过程，应使用
21、适当精密度和准确度的设备对关键运行参数进行记录，例如使用规格适当的记录仪记录灭菌过程的时间/温度趋势等。尤其重要的是，应在被灭菌品或灭菌腔室冷点处安装温度探头，通过记录仪记录该点的温度情况，该冷点通过验证确定。为提高此温度参数的可靠性，应在同一部位安放另一支独立的测温探头，用显示仪表显示温度数值，供操作人员直接与记录仪记录的趋势图进行对照。灭菌图谱或其复印件应收录入批记录中。可使用化学或生物指示剂，但它们不得替代物理测定。,灭菌器的程序控制和记录仪表,原则要求开始测定灭菌时间前，应有足够的时间，保证所有被灭菌品都升高到所规定的灭菌温度。必须确定每种装载方式所需的升温时间在灭菌高温阶段后，应采取
22、措施防止冷却期间已灭菌品遭受污染。任何与产品相接触的冷却用液体或气体都应经过灭菌或除菌处理以上均应有记录,灭菌器的程序控制和记录仪表,技术性要求应配置独立控制系统与记录系统：一为灭菌器的程序控制系统，此系统能显示，可有纸质记录、或将记录数据贮存于电脑硬盘及其它储存设备中；另一个为记录系统，通常为纸张形式输出的模拟曲线，曲线上包括温度、压力和时间的显示。一个容易忽视的方面温度探头的导线部分，导线外面的硅胶管是耐温、耐压和耐湿的。在使用过程中，当导线软管部分逐步老化时，其性能下降，水蒸气就可能会进入软管内部，因此会导致电阻值漂移，干扰测量、控制系统的稳定性与准确性。选购时应十分注意温度探头的质量，避免因小失大。,
