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1、一、花药培养的定义花药培养: 将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。,二、花药培养的历史 20世纪60年代中期Guha和Maheshwari(1964，1966)首次报道由毛曼陀罗花药培养获得了大量花粉起源的单倍体以来，这项技术已被成功地推广到至少52个属的153个种，其中包括不少有重要经济价值的植物。,三、花药培养的意义迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩短育种年限获得育种中间材料突变体选育体细胞融合获得染色体异附加系和代换系遗传研究遗传工程受体,1、取材 花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的
2、发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。一般而言，花粉处于单核后期的花药对培养反应较好，在烟草中，此时花蕾的花冠大约与萼片等长,四、花药培养的一般程序,2、预处理适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草79，714 d；水稻71O，1015 d；黑麦13，714 d；大麦37，714 d。但低温预处理对小麦效果不稳定，有时还有负效果。,四、花药培养的一般程序,3、消毒花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态，因此，通常只要以70% 酒精喷洒或擦拭
3、花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。,四、花药培养的一般程序,4、接种把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。 由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。,四、花药培养的一般程序,5、培养方式在琼脂固化培养基表面培养;在加人30Ficoll的液体培养基表面飘浮培养利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水,四、花药培养的一般程序,6、培养条件对于大多数小麦品种来说，在培
4、养的最初6d给以3032 的较高温度，然后再转入2830下培养。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27。对光照的要求在物种间差异更为明显，例如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好。,四、花药培养的一般程序,7、单倍体植株的二倍化秋水仙素处理诱导染色体加倍： 禾本科植物，一般都是在分蘖盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘖节；把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部叶片的腋芽上，然后把主茎的顶芽去掉，以刺激侧芽长成二倍体的可育枝条。采用愈伤组织和试管苗染色体加倍。把幼小的花粉植株浸于过滤灭菌的O.4秋水仙素溶液中96h（烟草
5、），然后转移到培养基上使其进一步生长。,四、花药培养的一般程序,五、影响雄核发育的因子雄核发育指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株的过程。基因型生理状态：幼年植株的花药反应能力较好花粉发育时期：一般而言单核后期花药对培养反应较好 药壁因子：花药壁对同一物种及不同物种离体花粉雄核发 育有看护作用。培养基：基本培养基、碳源、植物激素、活性炭,烟草花药培养实验,一、实验目的：掌握花药培养和外植体取材的方法二、实验材料：烟草的蕾期植株,烟草的蕾期植株,三、实验方法和步骤：,不同大小的烟草花蕾,1、取材与预处理：摘取花冠长度为21-23mm的花蕾（花冠与萼片等长，此时单核花粉行将完成第1次有丝分裂），置于
6、7-9低温下预处理7天。,2、配制培养基 MS基本培养基，添加30克蔗糖，5克活性炭。 1号； 不加激素； 2号； 2，4-D 0.2mg/L + BA 0.1mg/L；3、烟草花蕾表面消毒将烟草花蕾在70%酒精中浸数秒，倒掉酒精， 再用0.1%升汞处理 8min后，无菌水冲洗4次。,三、实验方法和步骤：,4、接种：剥去萼片和花瓣，将花药取出。由不同花蕾取出的花药各为一组分别放置。由每组中取出1个花药，用醋酸洋红压片，以确定花粉发育时期。如果在用于压片的花药中花粉正处于适当的发育时期，即花粉第1次有丝分裂期，则将该花蕾的所有其余花药进行培养。且接种前必须将花丝去掉。每瓶培养基接种6个花药。、培
7、养：花药接种后，放在培养室内，25 条件下见光培养。,三、实验方法和步骤：,6、结果观察花药培养2-3周后，在载玻片上加一滴醋酸洋红，在醋酸洋红中剖开培养的花药，即可看到幼龄的花粉胚。培养5周后，花粉胚形成小植株。,花粉胚形成的小植株,三、实验方法和步骤：,7、当小植株长到适当大小时，取根尖用醋酸洋红染色，以证实它们的单倍染色体数。8、当需要进行染色体加倍时，可将刚长出小植株不久的花药浸入灭过菌的浓度为0.5%的秋水仙素溶液中24-48小时，然后用无菌水洗净，将小植株接入无激素培养基中培养。,三、实验方法和步骤：,1、观察花粉胚小植株形成的过程，并统计花粉胚小植株形成的频率。2、证实花粉胚小植株染色体的倍数。,四、作业：,
