现代分析技术与应用：第十六章色谱分析法概论课件.ppt

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1、现代分析技术与应用,第十六章 色谱分析法概论第十七章 气相色谱法 第十九章 平面色谱法蒋先兴,第十六章 色谱分析法概论 chromatography,色谱法概述,色谱法是什么？一种将混合物各组分分离并分析的方法。如何做？物理或物理化学原理分离分析应用范围？生命科学、材料科学、环境科学等领域为什么要学？各国药典及其他标准的法定方法。纯度检查、定性鉴别或含量测定。,色谱过程和基本原理,基本类型色谱方法及其分离机制,色谱法基本理论,本章学习内容,基本条件：必须具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次

2、“分配”的过程。,第一节 色谱过程和基本原理,组分的结构和性质微小差异,与固定相作用差异,随流动相移动的速度不等,差速迁移,色谱分离,色谱过程,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线(chromatogram)由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。 基线(baseline)在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器 (主要是检测器) 的噪音随时间的变化。,对称因子fs (symmetry factor) ：衡量色谱峰的对称性,色谱峰(peak)：流出曲线上的突起部分,二、色谱流出曲线和有关概念,正常峰,前延峰,拖尾峰,对称因子：,0.95-1.05,大于1.

3、05,小于0.95,前陡后平,前平后陡,二、色谱流出曲线和有关概念,二、色谱流出曲线和有关概念,定性参数（Qualitative）,定量参数（Quantitative）,柱效参数,保留时间(retention time;tR)从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔死时间(t0)不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间 调整保留时间(tR)某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。,（一）定性参数,保留体积(VR)从进样开始到组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。,死体积(V0)由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。固定相颗粒间

4、间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。,（一）定性参数,调整保留体积(adjusted retention volume)由保留体积扣除死体积后的体积,相对保留值(r) 两组分的调整保留值之比,（一）定性参数,峰高(peak height；h)组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。 峰面积(peak area；A)色谱曲线与基线间包围的面积。,(二）定量参数（Quantitative）,返回,标准差(standard deviation；)正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。越大，组分越分散；反之越集

5、中。半峰宽(W1/2)：峰高一半处的峰宽 W1/2=2.355 峰宽 (peak width；W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。W=4 或W=1.699W1/2,（三）柱效参数,总分离效能指标分离度(resolution；R)：相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。,R=1，95.4%R=1.5， 99.7%中国药典规定定量分析R1.5,（三）柱效参数,分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。,三、分配系数与色谱分离,1.分配系数 (distribution coefficient；K)在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相 (s) 与流动

6、相 (m) 中的浓度 (C) 之比。,温度、压力、固定相和流动相的体积有关。,保留因子与分配系数的关系,三、分配系数与色谱分离,2. 保留因子(capacity factor；k)在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。又称为质量分配系数或分配比。,三、分配系数与色谱分离,3. 保留时间与保留因子、分配系数的关系,色谱法基本公式,保留因子：组分在色谱柱中多停留时间与死时间的比值。,4.色谱分离的前提,KAKB 或kAkB,tAtB,三、分配系数与色谱分离,流动相与固定相的分子聚集状态分类 气相色谱法、液相色谱法操作形式分类 柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法

7、分离机制分类 分配色谱法、吸附色谱法,第二节 色谱方法分类及其分离机制,分配色谱法(partition chromatography)吸附色谱法(adsorption chromatography)离子交换色谱法(ion exchange chromatography)分子排阻色谱法(molecular exclusion chromatography),第二节 色谱方法分类及其分离机制,固定相？流动相？分离原理？,第二节 色谱方法分类及其分离机制,（一）分配色谱法,原理：溶解度差别固定相：通过化学键合相涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体。流动相： 气体气液分配色谱 液体液液分配色谱,洗脱顺序,

8、K越大，越易保留在固定相中，前行速度越慢,K的影响因素：流动相种类性质，固定相的极性和温度,（一）分配色谱法,分配系数：,气液分配色谱：固定相极性、组分沸点和极性等,液液分配色谱：库仑力和氢键作用力，相似相溶原则,（一）分配色谱法,洗脱顺序,原理：吸附能力的差别固定相： 多孔性微粒状物质 较大的比表面积，吸附中心多常用：硅胶（硅醇基）、氧化铝,（二）吸附色谱法,（二）吸附色谱法,固定相和流动相,流动相： 气体气固吸附色谱 有机溶剂液固吸附色谱,洗脱顺序 ka=KaSa/Vm在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。Ka与组分的性质（极性

9、、取代基的类型和数目、构型有关）。,（二）吸附色谱法,洗脱顺序,以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。画出结构式饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强 (但要考虑其他因素的影响) 。不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。分子中取代基的空间排列,（三）离子交换色谱法,原理：组分离子交换能力的差别固定相：离子交换剂(ion exchanger) 离子交换树脂（resin）和硅胶化学键合离子交换剂。,流动相：一定pH和离子强度的缓冲溶液，加入少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以提高选择性。

10、,分类： 阳离子交换色谱法 阴离子交换色谱法。阳离子交换：阴离子交换：离子交换通式：,（三）离子交换色谱法,KA/B是离子对树脂亲和能力相对大小的度量KA/B越大，A的交换能力大，越易保留常选择某种离子（如H+或Cl）作参考,（三）离子交换色谱法,交换反应的平衡常数即选择性系数：,KA、 KB为A、B的分配系数,影响保留行为的因素：被分离离子、离子交换剂、流动相的性质等(1) 离子的电荷和水合半径：价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径, 选择性系数小。,（三）离子交换色谱法,(2)离子交换剂的交联度和交换容量:在一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，则组分的保

11、留时间越长。 (3)流动相的组成：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。流动相的离子强度高，使组分的保留值降低。 流动相的pH：溶质的离解受到抑制则保留时间变短。弱离子交换树脂的交换容量在某一pH值有极大值。,（三）离子交换色谱法,（四）空间排阻色谱法,分离原理：根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。也称为分子排阻色谱法。,固定相：多孔凝胶（软质、半软质和硬质）,（四）空间排阻色谱法,空间排阻（steric exclusion）理论：孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态渗透系数： Kp =Xs/Xm （0Kp1 ）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内

12、，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。,主要性能参数平均孔径排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。,（四）空间排阻色谱法,（四）空间排阻色谱法,流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography；GFC)水溶性试样，流动相为水溶液凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography；GPC)非水溶性试样，流动相为四氢呋喃、氯仿等有机溶剂,VmV0,分子线团尺寸（分子量）大

13、的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。,（四）空间排阻色谱法,保留体积与渗透系数的关系,小结,色谱过程方程式：分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。,小结,K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。,药化实验室产物纯化：A和B无法分开时的解决方法：1、柱子装高一些2、洗脱剂极性降低一些3、洗脱剂洗脱速度慢一些，慢慢过,为什么？,提高柱效！,塔板理论 速率理论,第三节 色谱法基本理论,色谱柱：

14、组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。,假设前提：在色谱柱内每一“塔板”H内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。分配系数在各塔板内是常数。纵向扩散可以忽略。,塔板理论（热力学）,（四）空间排阻色谱法,1、单一组分B（kB=0.5）的分配和转移 设色谱柱的塔板数n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）号。 将单位质量的B加到第0号塔板上。分配平衡后，0号塔板内ms/mm0.333/0.667。进入一个塔板体积的流动相（一次转移），,塔板理论（热力学）,质量分配和转移,经过N次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式。,如N=3，

15、展开式为：(0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296,0 1 2 3号,转移N次后，第r号塔板中的质量Nmr：,塔板理论（热力学）,例：转移3次后，在第2号塔板内的溶质分数,注意：1、柱出口处的质量分数的计算。2、质量（浓度）最大点的N，即保留体积。,塔板理论（热力学）,组分B(kB=0.5)在n=5的色谱柱内及出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 4 0.012 0.

16、099 0.269 0.395 0.198 0 5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.132 6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.219 7 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0.219 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068,A(kA=1)和B(kB=0.5)两组分,塔板理论（热力学）,两组分的分离,组分A(kA=1)在n=5的色谱柱内和出口的分布 N r 0 1

17、2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.137 9 0.002 0.018 0.072

18、0.166 0.247 0.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124,两组分开始分离，k小的组分B在柱后先出现浓度极大值, 即先出柱。,塔板理论（热力学）,两组分的分离,组分B: k=0.5, 当N=6和7时，柱出口产生B的浓度最大点。组分A：k=1，N=8和9时，柱出口处达到浓度最大点。,塔板理论（热力学）,两组分的分离,一根色谱柱n=103以上，组分有微小的分配系数(容量因子)差别即可实现完全分离。分配系数(容量因子)不等是分离的前提。,k小的组分在先出柱。,塔板理论（热力学）,流出曲线方程,1.二项式分布曲线以组分A在柱出口处的质量分数对N作图

19、。,k=1的组分从n=5色谱柱中的流出曲线图,N 柱出口0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0.032 6 0.079 7 0.118 8 0.137 9 0.137 10 0.124,塔板理论（热力学）,流出曲线方程,色谱流出曲线:当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。,:标准差 C:任意时间t时的浓度 C0:峰面积A，即相当于某组分的总量,Cmax即流出曲线的峰高h。一定时， 峰高h取决于C0。C0一定时， 峰高h取决于。,t=tR时，C有极大值：,塔板理论（热力学）,流出曲线方程,不论ttR或ttR时，浓度C恒小于CmaxC随时间t向峰两侧对称下降。越小，峰越锐。是柱效的标志

20、,塔板理论（热力学）,流出曲线方程,流出曲线方程的常用形式：,以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355 ,峰面积:,A = h(2)1/2,A=1.065W1/2h,色谱定量的参数,塔板理论（热力学）,流出曲线方程,色谱峰面积:,理论塔板高度(height equivalent to atheoretical plate或plate height, H) 理论塔板数(plate number, n),色谱柱效参数。,塔板理论（热力学）,理论塔板高度和理论塔板数,塔板理论（热力学）,理论塔板高度和理论塔板数,理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间的关系：,理论塔板高度:H =L

21、/n,注意：计算n时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间单位一致,有效理论塔板数和有效理论塔板高度:,Hef =L/nef,公式总结,在柱长2m、5%阿皮松柱、柱温100、记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测定苯的保留时间为1.50min，半峰宽为0.10cm。求该柱的理论塔板高度和每米的理论塔板数。,塔板理论（热力学）,理论塔板高度和理论塔板数,示例：,每米理论塔板数为：1000/1.6=0.6103(m1),塔板理论（热力学）,理论塔板高度和理论塔板数,塔板高度的统计概念：单位柱长引起的分子的离散度 H=2/L 2HL 是组分分子在色谱柱内离散的度量2是总的离散程度，即单位柱长内分子

22、离散的累积,塔板理论解释了流出曲线的形状说明了组分的分配和分离过程提出了评价柱效的指标但某些假设与实际色谱过程不符,塔板理论（热力学）,小结,速率理论（动力学）,塔板理论的不足：组分在两相中不可能真正达到分配平衡；组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略;没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响；无法解释柱效与流动相流速的关系；不能说明影响柱效有哪些主要因素。,1956年，荷兰学者范第姆特(Van Deemter)提出了色谱过程动力学理论速率理论。,塔板高度,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,速率理论（动力学）,H = A + B/u + Cu,影响H 的动力学因数,速率理论（动力学）,涡流扩散(ed

23、dy diffusion，多径扩散）,柱填充不均匀使同一个组分分子经过不同的长度途径流出色谱柱,A：涡流扩散系数，其单位为cm。：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形状决定。dp：填料 (固定相) 颗粒的平均直径， dp小， A小；但dp 太小，和柱阻大。,A=2dp,涡流扩散,浓度梯度的存在造成的区带展开,速率理论（动力学）,纵向扩,纵向扩散（longitudinal diffusion，分子扩散),扩散系数：B=2Dm,：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散的阻碍。 Dm：组分在流动相中的扩散系数。,传质阻抗：影响传质过程的阻力。结果：组分无法在两相间瞬间平衡，使有些分子较快向前移动，而另一

24、些滞后，引起峰展宽。传质阻抗系数C，其单位s ，包括 Cm、Cs,速率理论（动力学）,传质阻抗,传质阻抗(mass transfer resistance)组分分子与固定相或流动相分子间相互作用的结果 .传质过程：溶解扩散转移,速率理论（动力学）,流动相线速度u,涡流扩散A不受u影响纵向扩散B/u： u, H传质阻抗Cu：（ Cm、Cs ） u, H,u 较低时： B/u主导， u 升高，H降低，柱效升高, u 较高时：Cu主导，u升高,H升高,柱效降低塔板高度最小值，u 最佳,第四节 色谱法的发展概况（自学）,一、色谱法的历史二、色谱法的现状和发展趋势色谱联用技术实验二气相色谱-质谱联用液相

25、色谱-质谱联用,第十六章 色谱分析法概论,主要内容,色谱过程和分离原理基本概念和计算公式：保留值、分配系数、容量因子、n、H、R色谱基本理论：塔板理论、速率理论基本类型色谱机制,实验四 红外分光光度法测定,一、实验目的1、掌握红外光区分析时固态试样的制备方法。2、了解如何从红外光谱图中识别基团以及如何从这些基团确定未知化合物的主要结构。,三、红外光谱仪操作规程,1开机打开电源开主机开计算机打开OMNIC2制样（KBr压片法）取100毫克左右干燥的KBr（市售分析纯KBr可满足一般红外分析要求），1毫克左右样品在玛瑙研钵中混合研磨，使平均颗粒尺寸为2um左右。试样与KBr的比例与试样的结构有关。对于具有强极性官能团的物质样品与KBr的比例可达1：600，对于极性小的样品KBr的比例可减少。,3采集样品谱图（Collect菜单）从Collect菜单中选择Collect Sample，按屏幕出现的指南操作4数据处理（Process菜单）,三、红外光谱仪操作规程,